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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2007/3912/


Entwicklung eines immunchemischen Nachweisverfahrens für Cefquinom

Thal, Johannes


Originalveröffentlichung: (2006) Giessen : VVB Laufersweiler 2007
pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.143 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Nahrungsmittelkunde, Professur für Milchwissenschaften
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-8359-5097-5
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 09.01.2007
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung eines enzymimmunologischen
Verfahrens zum Nachweis des Cephalosporinantibiotikums Cefquinom in Milch. Hierzu wurden erstmals spezifische Antikörper gegen Cefquinom hergestellt. Zur Herstellung eines immunogenen Cefquinom-Protein-Konjugats wurde Cefquinom mittels Glutardialdehyd an Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) gekoppelt (Cefquinom-GAKLH).

Mit diesem Konjugat wurden 4 Kaninchen immunisiert. Die gewonnenen Antiseren
wurden jeweils im Hinblick auf spezifische Antikörpertiter überprüft und diejenigen
Antiseren mit den besten Testeigenschaften einer weiteren Charakterisierung unterzogen.

Zur Entwicklung eines kompetitiven direkten Enzymimmuntests wurde Cefquinom unter
Verwendung verschiedener Kopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an das Enzym
Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Unter Verwendung von Anti-Cefquinom-
Antiserum eines Tieres (K17) sowie eines mittels p-Benzoquinon-Kopplung hergestellten
Konjugates (Cefquinom-BQ-HRP) konnte ein Testsystem erarbeitet werden, das den
Nachweis von Cefquinom mit einer Nachweisempfindlichkeit im Bereich des MRL für
Cefquinom von 20 ng/ml erlaubte.

Für die Entwicklung eines kompetitiven indirekten enzymimmunologischen
Nachweisverfahrens wurde Cefquinom unter Verwendung verschiedener
Kopplungsreagenzien bzw. Synthesereaktionen an Trägerproteine (bovines Serumalbumin,
BSA, Glucose Oxidase, GOx) konjugiert. Unter Verwendung eines mittels
Glutardialdehydkopplung hergestellten Cefquinom-GA-BSA-Konjugates oder eines
mittels wasserlöslichem Carbodiimid (CD) hergestellten Cefquinom-CD-GOx-Konjugates
konnten unter Verwendung der Antiseren zweier Tiere (K17, K20) Enzymimmuntests
etabliert werden.

Die höchste Testsensitivität wies eine Kombination aus Antiserum K17 und Cefquinom-
CD-GOx-Konjugat als Beschichtungsantigen auf. Diese Kombination wurde als
Standardverfahren für den Nachweis von Cefquinom etabliert. Hier konnten
Nachweisgrenzen für Cefquinom-Standardlösungen im Konzentrationsbereich von 1-2
ng/ml erreicht werden. Das Testsystem war hochspezifisch und wies keine meßbaren
Kreuzreaktionen mit 25 getesteten anderen Cephalosporinen bzw. Penicillinen auf.

Die Überprüfung der praktischen Anwendbarkeit des Nachweissystems zum Nachweis von
Cefquinom anhand künstlich kontaminierter Rohmilch bzw. pasteurisierter Konsummilch
zeigte, dass im Konzentrationsbereich des MRL (10, 20 bzw. 40 ng/ml)
Wiederfindungsraten von 80-103% erreichbar waren. Hierzu wurden die Cefquinom-
Standardlösungen in 5% (Konsummilch) bzw. 10% (Rohmilch)
Magermilchpulverlösung/PBS) hergestellt.

Der in dieser Arbeit entwickelte Test ermöglicht somit die Identifizierung und
Quantifizierung von Cefquinom in Milch, mit vergleichbarer Empfindlichkeit sie wie für
physikalisch-chemische Referenzverfahren beschrieben wurde.
Kurzfassung auf Englisch: The presented study describes the development of an enzyme immunoassay (EIA) for the
detection of the cephalosporin antibiotic cefquinome in milk samples. For this purpose it
was necessary to develop specific antibodies against cefquinome, which to our knowledge
had not been achieved before. To create an immunogenic complex, we had to bind
cefquinome to the protein keyhole limpet hemocyanin which was accomplished using
glutardialdehyde (Cefquinome-GA-KLH). We inoculated 4 rabbits with this immunogenic
conjugate. The received sera were tested for specificity and the best sera were further
characterized.

For the development of a competitive direct EIA, cefquinome was bound to horseradish
peroxidase (HRP) using different coupling substances and several methods of synthesis. A
test was developed with the serum of one rabbit (No 17) against cefquinome and a
p-benzoquinone bound conjugate of cefquinome and HRP. This test was able to detect
cefquinome in the range of the maximum residue limit (MRL) of 20 ng/ml.
For the development of a competitive indirect EIA, cefquinome was coupled to anchor
proteins like bovine serum albumin (BSA) and glucose oxidase (GOx). This was achieved
using different binding substances and methods. An EIA was developed with the sera of
two rabbits (No. 17 and 20) and cefquinome-GA-BSA as well as with a conjugate of
cefquinome, carbodiimidazole (CD) and GOx.
The test with a combination of the serum of rabbit No. 17 and Cefquinome-CD-GOx had
the greatest sensitivity. With this combination a standard test for the detection of
cefquinome was established. The lowest detectable amount of cefquinome standard was 1-
2 ng/ml. The EIA was highly specific for cefquinome and no cross reactivity was observed
against 25 different cephalosporins and penicillins.
The practical applicability of this EIA for the detection of cefquinome was verified with
artificially contaminated raw milk and pasteurized milk. The milk was inoculated with 10,
20 and 40 ng/ml cefquinome which lies in the range of the MRL. The recovery rate was
about 80 to 103%. The cefquinome standard was dissolved in 5% (pasteurized milk) and in
10% (raw milk) skimmed milk-powder/PBS.
With the EIA that was developed in this study, it is possible to identify and quantify
cefquinome in milk with the same sensitivity as physical-chemical reference tests.