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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-38682
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2006/3868/


Durchflusszytometrie thrombozytärer Oberflächenantigene : Änderungen im Langzeitverlauf in einer Population gesunder Erwachsener

Investigation of antigenes on the platelet surface by flow cytometry : changes in long time run within a population of healthy adults

Fromm, Annette


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Durchflusszytometrie , Thrombozytenaktivierung , CD 62p , GpIIb/IIIa , Rezeptorquantifizierung
Freie Schlagwörter (Englisch): flow cytometry , platelet aktivation , CD 62p , GpIIb/IIIa , receptor count
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Medizinisches Zentrum für Neurologie und Neurochirurgie, Neurologische Klinik
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 14.12.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der durchflusszytometrischen Analyse der Aktivität von Thrombozyten innerhalb eines gesunden Probandenkollektivs. Sie soll die Frage klären, inwiefern eine Grundaktivierung der thrombozytären Gerinnung auch bei Personen ohne wesentliche Risikofaktoren, wie z.B. hämodynamisch relevante Karotisstenosen, vorliegt, ob Geschlechts- oder Altersunterschiede bestehen, und ob im Rahmen einer Längsschnittbeobachtung über 5 definierte Zeitpunkte innerhalb von 3 Monaten Fluktuationen der thrombozytären Aktivität auftreten.

Die Identifizierung der Thrombozyten aus der Vollblutprobe erfolgte anhand des Rezeptors CD 42b (Gp Ib) über Bindung eines fluorochrom-markierten, spezifischen Antikörpers. Auf entsprechende Weise wurde eine Quantifizierung der Rezeptoren CD 41, CD 42b, CD 61 und CD 62p vorgenommen.

Als Marker der Thrombozytenaktivierung dienten CD 62p (P-Selektin bzw. GMP 140), ein unter Aktivierung aus den im Inneren der Thrombozyten gespeicherten α-Granula freigesetzter Oberflächenrezeptor, sowie PAC-1, ein Antikörper, welcher ein durch Konformationsänderung im Rahmen der Aktivierung freigesetztes Epitop am GpIIb/IIIa-Rezeptor (CD41/CD61) markiert. Durch die Markierung der Zellen anhand spezifischer Antikörper ist eine Trennung der Thrombozyten von anderen Partikeln gleicher Größe, die Unterscheidung der Zellformen singuläres Plättchen, Aggregat oder Mikropartikel sowie die Bestimmung deren prozentualer Anteile sicher möglich, welche wiederum Rückschlüsse auf den Aktivierungszustand der Thrombozyten zulassen.

Es zeigten sich keine signifikanten Abweichungen oder Alterabhängigkeiten von den allgemein angewandten Normwerten bezüglich der Thrombozytenzahlen, jedoch fielen die Zählungen im weiblichen Geschlecht insgesamt höher aus.
Der CD 42b-Rezeptor wurde mit etwa 27.000 je Thrombozyt quantifiziert, Frauen verfügten über eine höhere Anzahl dieser Rezeptoren als Männer. Die Quantifizierung von CD 41 und CD 61 als den GpIIb/IIIa-Rezeptor bildende Variablen ergab eine weitestgehend konstante Anzahl von ca. 41.000 je Zelle für CD 41 und ca. 39.000 je Zelle für CD 61. In der Gruppe mit höherem Lebensalter wurden signifikant niedrigere Rezeptorzahlen pro Thrombozyt für CD 41, CD 42b und CD 61 beobachtet.

Die Anzahl an CD 62p-Rezeptoren auf ruhenden, nicht aktivierten Plättchen konnte auf etwa 500 je Zelle quantifiziert werden. Sowohl CD 62p als auch PAC-1 als Aktivierungsmarker zeigten sich unabhängig vom Geschlecht, jedoch mit signifikant zunehmender Anzahl bei steigendem Alter als Ausdruck erhöhter Aggregationsbereitschaft.

Es wurde der gegenläufige Zusammenhang zwischen der Anzahl ruhender Thrombozyten einerseits und zunehmender Aggregatbildung und Mikropartikelabfall andererseits mit zunehmendem Grad der Aktivierung deutlich.
Kurzfassung auf Englisch: This study is meant to analyze platelet activation of healthy people by flow cytometry. The questions to be answered are: what is the basic level of platelet coagulation activity with people that do not have a higher risk for stroke (for example hemodynamic relevant stenosis of the carotids), are there any differences concerning age or sex, and how far is this level changing in between an investigated period of 3 months.

For platelet identification we used fluorescence marked anti-CD 42b-Mab that binds to the GpIIb/IIIa receptor and can easily be identified and counted by flow cytometry. The same way we quantified the count of CD 41, CD 42b, CD 61 and CD 62p on the platelet surface.

As markers for platelet activation we used anti-CD 62p-Mab (expressed from the platelet’s inside under activation) and PAC-1 (marks an epitope of Gp IIb/IIIa shown under activation). Because of the specific antibodies and marking by fluorocrome flow cytometry is able to identify platelets out of particles of the same size and it is also able to differentiate and count single platelets, aggregates and microparticles what gives even more information about activation level.

The results did not show variation from known standards concerning platelet count. Also there was no dependence to the age. But we found higher platelet counts with women.

CD 42b was quantified with about 27.000 receptors on each platelet surface, women showed more receptors of this type than men. Quantification of CD 41 and CD 61 (both are part of the Gp IIb/IIIa receptor) counted constantly about 41.000 CD 41 receptors and about 39.000 CD 61 receptors on each platelet’s surface. We found significantly decreasing receptor counts for CD 41, CD 42b and CD 61 with increasing age.

CD 62p, expressed on the platelet surface from the platelet’s inside under activation, was quantified with about 500 receptors/ platelet. Both counts of CD 62p and PAC-1 did not vary during the analyzed period or did show differences concerning the sex, but were significantly increasing with increasing age.
It was shown that the less the amount of single platelets, the less the amount of microparticles and the higher the amount of platelet aggregates and CD 62p expression as activation markers.