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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2006/3815/


hp66 protein paralogs : SUMO modification and complex formation

hp66 protein paralogs

Gong, Zihua


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Freie Schlagwörter (Deutsch): hp66 , SUMO modification , complex formation
Freie Schlagwörter (Englisch): hp66, SUMO modification , complex formation
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Genetisches Institut
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 28.11.2006
Kurzfassung auf Englisch: Methylation of CpG dinucleotides in eukaryotes is an epigenetic mark that is implicated in transcriptional silencing. Methyl-CpG binding protein MBD2 serves to recruit the Mi-2/NuRD repressive complex to a methylated promoter. Human p66alpha and p66beta, which are components of Mi-2/NuRD complex, are two potent transcriptional repressors that interact with MBD2, but no details concerning the mechanism in hp66 proteins-mediated transcriptional repression have been described.

The current work showed that transcriptional repression mediated by hp66alpha and hpbeta is partially dependent on histone deacetylation. Two major repression domains in hpalpha, and one in hp66beta were characterized. In addition, the amino acid Lys-149 of hp66beta was identified to be essential for the interaction with MBD2 and the nuclear localization of hp66alpha. Emerging evidence indicated that SUMO (small ubiquitin-like modifier) modification negatively regulates the transcriptional activity of transcription factors. The study gave evidence that both hp66beta; and hpbeta proteins can be SUMOylated, and furthermore that SUMO modification enhances hp66-mediated transcriptional repression. Two major SUMO modification sites at Lys-30 and Lys-487 of hp66alpha, and one major SUMO modification site at Lys-33 of hpbeta were identified. Mutational analysis of the SUMO modification sites in hp66alpha or hp66beta revealed that there is no change in localization in comparison to wild type hp66. But interestingly, the Mi-2/NuRD complex component HDAC1 (histone deacetylase 1) is recruited to the SUMO modification site Lys-30 of hp66alpha which shows TSA (Trichostatin A) sensitivity, whereas mutation of the SUMO modification site Lys-33, which shows TSA insensitivity, abolishes the interaction between hp66beta and RbAp46 (Rb associated protein 46) in vivo. Taken together, these results suggest that both, interactions within the Mi-2/NuRD complex as well as optimal repression are mediated by SUMOylation.

Moreover, to gain further insights into protein complexes containing hp66 proteins, stable cell lines expressing individually both hp66 proteins were established. After a two-step chromatographic purification and a subsequent FLAG affinity purification protein complexes were isolated. Western blotting analysis revealed that several subunits of the Mi-2/NuRD complex as well as MBD2, and PRMT5 were found to be associated with FLAG-hp66 proteins.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Methylierung von CpG-Dinukleotiden in Eukaryotes ist eine epigenetische Markierung, die eine Unterdrückung der Transkription der Gene in den betroffenen Bereichen des Genoms zur Folge hat. Hierbei rekrutiert das Methyl-CpG bindende Protein MBD2 den reprimierenden Mi2/NuRD Komplex an methylierte Promotoren. Die Proteine p66alpha und p66beta sind Bestandteile dieses Komplexes und fungieren als starke Repressoren, jedoch sind bisher keine Details zum Mechanismus der transkriptionellen Repression durch diese Faktoren beschrieben.


Die vorliegenden Untersuchungen belegen eine Beteiligung der Deacetylierung von Histonen an der transkriptionellen Repression durch p66alpha und p66beta. Zwei Repressions-Domänen in p66alpha und eine in p66beta wurden charakterisiert. Weiterhin zeigte sich, dass die Aminosäure Lysin an Position 149 von p66alpha essentiell für die Interaktion mit MBD2 und die Lokalisation von p66alpha innerhalb des Zellkerns ist. Eine Analyse von p66 auf eine mögliche SUMO (small ubiquitin-like modifier)-Modifikation, die in zunehmenden Maße mit der Regulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren in Verbindung gebracht wird, identifiziert p66alpha und p66beta als Zielproteine dieser Modifikation. Sowohl bei p66alpha, als auch bei p66beta führt die SUMO-Modifikation zu einer Verstärkung der transkriptionellen Repression. Die SUMO-Modifikation erfolgt an Lysin 30 und Lysin 487 in p66alpha und an Lysin 33 in p66beta, wobei die Mutation der SUMO-Zielsequenzen verglichen mit den Wildtyp p66 Formen bei beiden Proteinen keine Veränderung der zellulären Lokalisation hervorruft. Darüber hinaus wird HDAC1 (Histonedeacetylase 1) des Mi2/NuRD Komplexes an Lysin 30 von p66alpha, das eine TSA (Trichostatin A) sensitive Repression aufweist, rekrutiert. Die Mutation von Lysin 33, die keine Sensitivität gegenüber TSA zeigt, hebt die Interaktion zwischen p66beta und RbAp46 (Rb Associated protein 46) in vivo auf. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass sowohl die Interaktion innerhalb des Mi2/NuRD Komplexes, als auch die optimale Repression durch SUMO-Modifikation vermittelt wird.


Zur detaillierten Analyse von p66 enthaltenden Proteinkomplexen wurden stabile Zelllinien, die rekombinante p66 Proteine exprimieren etabliert. Die Isolierung der Proteinkomplexe erfolgte durch zweistufige chromatographischer Trennung und anschließende Reinigung über die mit p66 verknüpfte Affinitätsmarkierung. Western-Blot Analysen zeigten, dass die rekombinanten p66 Proteine mit verschiedenen bekannten Komponenten des Mi2/NuRD Komplexes, wie MBD2 und PRMT5, assoziiert vorliegen und belegen damit die Eignung dieses Systems für eine weitere Charakterisierung der p66 Komplexe.