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Einfluss von Angiotensin II auf die Motilität humaner Spermatozoen und Charakterisierung beteiligter Rezeptoren

Alejandre Lafont, Enrique


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Angiotensin II , Spermatozoen , AT1 , AT2
Freie Schlagwörter (Englisch): Angiotensin II , sperm , AT1 , AT2
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Medizinisches Zentrum für Dermatologie und Andrologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 23.06.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Das Renin-Angiotensin-System (RAS) ist ein ubiquitär im menschlichen Organismus vorhandenes Regulationssystem. Neben dem systemischen RAS, das vor allem an der Blutdruckregulation beteiligt ist, existiert ein gewebeständiges RAS, dessen Funktion für die meisten Gewebe nicht vollständig geklärt ist. Das RAS setzt sich zusammen aus den Enzymen Prorenin, Renin und Angiotensin-Converting-Enzyme (ACE). Substrat der Kininase ACE ist Angiotensin I (AI), das durch Renin aus Angiotensinogen entsteht. ACE wandelt AI in das hochaktive Oktapeptid Angiotensin II (AII) um. Die einzelnen Bestandteile dieser Peptidkaskade sind im männlichen und weiblichen Reproduktionstrakt nachweisbar. AII vermittelt seine Wirkung über spezifische Oberflächenrezeptoren, die als AII-Rezeptor Typ 1 (AT1) und Typ 2 (AT2) bezeichnet werden. ACE führt zur Bildung von AII aus AI. Neben ACE können weitere Enzyme wie Chymase, Cathepsin G und Carboxypeptidase A im Seminalplasma identifiziert werden, die vermutlich für den raschen AI-Abbau im Seminalplasma mitverantwortlich sind. Die Inaktivierung von AII erfolgt durch proteolytische Enzyme, die als Angiotensinasen bezeichnet werden. Das Testes-RAS wird wahrscheinlich durch Sexualhormone und Gonadotropine reguliert. Die genauen Mechanismen der Regulation auf molekularer Ebene sind jedoch weitgehend ungeklärt.
Diese Arbeit liefert den Nachweis der AII-Rezeptoren Typ 1 und 2 auf menschlichen Spermatozoen mittels Immunzytochemie und Immunoblot. Es wird weiterhin AII im Seminalplasma nachgewiesen und durch Untersuchungen an vasektomierten Männern die bislang noch nicht geklärte Produktionsstätte des im Seminalplasma nachweisbaren AII eingegrenzt. Schließlich wird der Einfluss von AII auf die Motilität humaner Spermatozoen untersucht und die Wirkung von AII-Rezeptorantagonisten auf diese Effekte getestet. Dabei wird auf eine korrekte statistische Auswertung geachtet.
AII ließ sich im Seminalplasma erstmals mittels quantitativem ELISA in einer Konzentration von 1 ng/ml nachweisen und liegt damit um den Faktor 20 über den in der Literatur beschriebenen Werten, welche noch mittels RIA bestimmt wurden. Der Grund dafür ist vermutlich, dass AII im Seminalplasma sehr schnell abgebaut wird was im Versuchsablauf dieser Studien nicht ausreichend berücksichtigt wurde. Vasektomierte Männer weisen die gleiche AII-Konzentration im Seminalplasma auf. Dies deutet darauf hin, dass das im Ejakulat vorhanden AII, nicht dem AII entspricht, das im Hoden nachweisbar ist.
Mittels Immunzytochemie ließen sich der AT1 und der AT2 auf menschlichen Spermatozoen nachweisen. AT1 ist postakrosomal, im Bereich des Flagellums und im Mittelstück lokalisiert. AT2 konnte erstmals in der akrosomalen Region nachgewiesen werden. Es gelang auch erstmalig der Nachweis beider Rezeptoren mittels Immunoblot. Diese Ergebnisse liefern das morphologische Korrelat der beobachteten Effekte von AII auf humane Spermatozoen (Induktion der AR über den AT2 und Steigerung der Motilität über den AT1).
AII beeinflusst die Motilität humaner Spermatozoen. Der größte Effekt auf die Motilität humaner Spermatozoen wurde nach Inkubation mit AII in einer Konzentration von 1nM über 60 min erreicht. Der Prozentsatz motiler Spermatozoen stieg unter AII um 19,5 %, während der Anteil immotiler Spermatozoen reduziert wurde. Zwischen den zwei gebildeten Gruppen andrologische Patienten und gesunde Probanden zeigte sich prinzipiell die gleiche Tendenz nach Zugabe von AII, nämlich eine Zunahme der Motilität. Die Motilitätszunahme durch AII konnte durch das Bluthochdruckmedikament Losartan®, einen spezifischen AT1-Antagonisten, und Saralasin, einen unspezifischen AT-Antagonisten, inhibiert werden. Hingegen konnte der spezifische AT2-Antagonist PD123319 in vorangehenden Untersuchungen zwar die akrosomale Reaktion durch AII verhindern, nicht aber die durch AII induzierte Motilitätszunahme.
Der medikamentöse Einfluss des RAS ist wesentlicher Bestandteil internistischer Bluthochdrucktherapie, die sich zunehmend auch auf junge Menschen, im reproduktionsfähigen Alter erstreckt. Die dabei beeinflussten Rezeptoren und Peptide lassen sich auf menschlichen Spermatozoen (AT1, AT2, ACE) und im Seminalplasma (AII) nachweisen. Die Auswirkungen dieser Therapie auf die Funktion humaner Reproduktionsorgane muss daher weiter untersucht werden, da sie weitgehend unklar sind, wenn auch gezeigt werden konnte, dass eine ACE-Hemmer-Therapie bei einer Schwangeren in der Embryonalperiode zu Fehlbildungen führt.
Diese Arbeit belegt durch den Nachweis der AII-Rezeptoren auf menschlichen Spermatozoen, von AII im Seminalplasma und den Effekten von AII auf humane Spermatozoen sowie den Einfluss von Rezeptorantagonisten auf diese Effekte, dass weitere Studien notwendig sind, um eventuelle Interaktionen einer internistischen Therapie mit der Reproduktion aufzudecken und eventuelle therapeutische Optionen, beispielsweise in IUI und IVF, aufzudecken.
Kurzfassung auf Englisch: The renin-angiotensin-system (RAS) is a widespread regulatory hormon system in the human organism. Besides the systemic RAS which mainly regulates blood pressure, there is also evidence for a local RAS with of hitherto mostly unknown function. The RAS is formed by the enzymes prorenin, renin, angiotensin converting enzyme (ACE) and by the substrates angiotensinogen, AI and the most active octapeptide AII. The different components of the cascade are present in the male and female reproductive system. AII exerts its effects on various tissues by interacting with two main types of cell surface receptors classified as type 1 (AT1) and type 2 (AT2). In previous experiments AII was shown to induce the acrosome reaction in human spermatozoa. Comparatively little is understood about the molecular mechanisms that regulate the events in normal and pathological functions of the gonads. Besides ACE and chymase, cathepsin G and carboxypeptidase A could be detected in human semen, possibly playing a role in AI degradation. By them and other unspecific proteolytic enzymes AI degradation occurs rapidly in human semen (data not shown). AII is inactivated by proteolytic enzymes called angiotensinases. The purpose of the present study was to investigate the effects of AII on human sperm motility using an appropriate statistic method, the influence of different AII-receptor blockers on AII-stimulated sperm motility, localization and characterization of the two angiotensin-receptor subtypes (AT1, AT2) on human spermatozoa and measurement of the AII-concentration in human seminal plasma. By investigating AII in seminal plasma of vasectomized patients, evidence for AII production outside the testis was found.
This study proves the presence of AT1 and AT2 on human spermatozoa using different methods such as immuncytochemistry and immunoblotting . For the first time AII was shown to be a component in human seminal plasma by ELISA. With 1ng/ml the concentration of AII was found to be 20 times higher than levels cited in the literature. The reasons remain unclear but are most likely because of the different ways of processing the samples, as AII is quickly degraded in human seminal plasma, a factor that had obviously not been considered sufficiently in these studies.
Vasectomized patients show the same amount of AII as normal men, which proves that the testis cannot be the location of the production of AII found in seminal plasma.
The strongest stimulatory effect on motility was demonstrated after incubation with 1nM AII for 60 min. The percentage of motile spermatozoa was significantly increased (∆19,5%). AII-stimulated motility was markedly inhibited by the AT1-receptor-selective antagonist Losartan® and the nonspecific receptor blocker saralasin. In contrast, the AT2-selective antagonist PD123319 showed no effect. Immunocytochemistry showed AT1-receptor immunoreactivity in the flagellum and midpiece of non-capacitated spermatozoa. The AT2-receptor was localized only in the acrosomal region. Furthermore AT1 and AT2 can be located on human spermatozoa by immunoblotting. AII concentration in human seminal plasma is about 1 ng/ml. There is a detectable variation of seminal AII concentration in patients. ACE connects to different cascades. On the one hand the kininogen cascade in which it deactivates active kinins, and on the other hand the angiotensin cascade in which it activates AII by cleaving two amino-acids from AI. AII exerts its effects on human spermatozoa by activating two different types of AII-receptors (AT), the AII receptor type 1 (AT1) and type 2 (AT2). The AT2 is found on the head of human spermatozoa. It is known that acrosome reaction is induced by AII and that this effect can be blocked by the specific AT2-antagonist PD123319 but not by AT1-antagonists. Thus, the AT2 was found using immunocytochemistry and immunoblotting on the head of human spermatozoa, whereas the AT1 was found in the midpiece and on the tail, giving proof of the results that AII can stimulate motility and speed (data not shown) of human spermatozoa, whereas the specific AT1-antagonist Losartan® and the non-specific AT-antagonist Saralasin can inhibit these effects. An increasing number of younger patients with high blood pressure have to take ACE inhibitors or AT1-antagonists. The involved receptors and enzymes are localized in the male reproductive systems, and little is known about the effects, that such a treatment has on male and female reproduction. Nevertheless, the treatment of pregnant women with ACE inhibitors caused embryopathia, wich demonstrates the severe effects that such a treatment can have on human reproduction. Therefore, further studies are necessary to investigate the effects of these drugs on male and female reproduction and a benefit for the treatment in IVF and IUI.