Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-28267
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2006/2826/


Regulation of Hepatitis C Virus translation by the viral internal ribosome entry site and the 3´-untranslated region

Die Regulation der Translation des Hepatitis C Virus durch die interne Ribosomen-Eintrittsstelle und die 3´-untranslatierte Region

Song, Yutong


Originalveröffentlichung: (2006) RNA, 11 (2005), S. 1809-1824
pdf-Format: Dokument 1.pdf (5.716 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Freie Schlagwörter (Deutsch): Hepatitis C Virus , Translation , interne Ribosomen-Eintrittsstelle
Freie Schlagwörter (Englisch): Hepatitis C Virus , translation , internal ribosome entry site
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut der Medizinischen Fakultät
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2006
Erstellungsjahr: 2006
Publikationsdatum: 11.05.2006
Kurzfassung auf Englisch: In this study, the regulation of translation of Hepatitis C Virus (HCV) by the internal ribosome entry site (IRES) and the 3´-untranslated region (3´-UTR) was investigated. The 3´-UTR stimulates HCV IRES-directed translation, and some known cellular RNA-binding proteins as well as a newly discovered 210 kDa protein specifically binding to the 3´-UTR may be involved in HCV translation regulation.

HCV, the main causative agent of non-A, non-B hepatitis (NANBH), belongs to the unique genus Hepacivirus in the family Flaviviridae. HCV has infected more than 170 million people worldwide, about 80 % of whom are unable to eliminate the virus, and those are at high risk to develop chronic liver diseases including cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The recent development of replicon systems has largely accelerated HCV research, but there is still no tissue culture system supporting a complete replication cycle of HCV, a circumstance that has slowed down studies on the basic understanding of the viral life cycle as well as drug and vaccine development.

The interactions of some known cellular RNA-binding proteins, including polypyrimidine tract-binding protein (PTB), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L (hnRNP L) and the protein encoded upstream of N-ras (Unr), with the HCV IRES and the 3´-UTR were examined. There is no direct interaction of PTB with the HCV IRES, but PTB binds specifically to the 3´-UTR. In contrast, hnRNP L binds to the IRES only. In addition, the binding of PTB to the 3´-UTR can be strengthened by hnRNP L, indicating that there is a synergistic interaction between PTB and hnRNP L. However, only a very slight positive effect of hnRNP L on HCV translation was observed in vitro. The recombinant Unr protein used in this work binds to the HCV 3´-UTR, but no significant effect of Unr on HCV translation could be observed in vitro.

Considering previous conflicting reports on a possible function of the HCV 3´-UTR in translation stimulation, it was found that reporter construct design is an important parameter in experiments testing 3´-UTR function. A translation enhancer function of the HCV 3´-UTR was detected only after transfection of monocistronic reporter RNAs and depends on a precise 3´-terminus of the HCV 3´-UTR. The 3´-UTR strongly stimulates HCV IRES-dependent translation in human hepatoma cell lines but only weakly in non-liver cell lines. Within the 3´-UTR the variable region, the poly(U/C)-tract and the most 3´-terminal stem-loop 1 of the highly conserved 3´-X region contribute significantly to translation enhancement, whereas the stem-loops 2 and 3 of the 3´-X region are involved only to minor extents. Thus, the signals for translation enhancement and the initiation of RNA minus-strand synthesis in the HCV 3´-UTR partially overlap, supporting the idea that these sequences along with viral and possibly also cellular factors may be involved in an RNA 3´-5´-end interaction and in a switch between translation and RNA replication.

In an initial attempt to search for trans-acting factors possibly involved in the translation initiation of HCV, no new protein was detected to bind to the HCV IRES. From the finding that the 3´-UTR stimulates translation, it was assumed that the translation initiation could be positively regulated by proteins binding to the 3´-UTR. This gave rise to a reconsideration of the experimental design of the HCV RNA constructs used for the search for new proteins, finally resulting in the discovery of a novel, yet unknown protein that binds to the HCV RNA. This unknown 210 kDa protein binds to the variable region of the HCV 3´-UTR only when a reporter RNA with exact 3´-terminus of 3´-UTR was used. This suggests that the protein may be involved in the regulation of translation stimulation by interacting, perhaps together with other yet undiscovered proteins, with the 3´-end of the HCV 3´-UTR, and the protein(s) may be involved in a switch from translation to negative-strand RNA synthesis in the life cycle of HCV.
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde die Regulation der Translation des Hepatitis C Virus (HCV) durch die Interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) und die 3´-untranslatierte Region (3´-UTR) untersucht. Die 3´-UTR stimuliert die Translation, und einige bekannte zelluläre RNA-bindende Proteine wie auch ein neu entdecktes 210 kDa-Protein binden an die 3´-UTR und sind möglicherweise an der Regulation der Translation von HCV beteiligt.

HCV, der Erreger der non-A, non-B-Hepatitis (NANBH), ist einziger Vertreter des Genus Hepacivirus in der Familie Flaviviridae. HCV hat mehr als 170 Millionen Menschen infiziert. Etwa 80 % von ihnen sind nicht in der Lage, das Virus zu eliminieren, und tragen ein hohes Risiko, chronische Leberkrankheiten wie Zirrhose und Hepatozelluläres Karzinom zu entwickeln. Ein seit kurzem verfügbares Replikon-System hat die HCV-Forschung stark beschleunigt, aber es gibt noch kein Zellkultursystem, das einen kompletten Infektionszyklus von HCV erlaubt, ein Umstand, der die Untersuchung des viralen Lebenszyklus wie auch die Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten noch erheblich verlangsamt.

In dieser Arbeit wurde die Interaktion einiger bekannter zellulärer RNA-bindender Proteine, des Polypyrimidine Tract-Binding Protein (PTB), des heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein L (hnRNP L) und des Proteins, das 'upstream of N-ras' codiert wird (Unr), mit der HCV IRES und der 3´-UTR untersucht. PTB bindet nicht an die IRES, aber an die 3´-UTR. Im Gegensatz dazu bindet hnRNP L nur an die IRES. Darüber hinaus fördert hnRNP L die Bindung von PTB an die 3´-UTR, was darauf hindeutet, dass beide Proteine synergistisch an die HCV-RNA binden. Allerdings konnte nur eine sehr geringe Stimulation der HCV-Translation durch hnRNP L in vitro festgestellt werden. Auch rekombinantes Unr-Protein bindet an die HCV 3´-UTR, aber in den hier durchgeführten in vitro-Experimenten konnte kein signifikanter Effekt auf die Translation festgestellt werden.

Aufgrund etlicher widersprüchlicher Berichte über eine mögliche Funktion der HCV 3´-UTR bei der Translation wurde hier festgestellt, dass mehrere Aspekte der Struktur der Reporter-Konstrukte wichtige Parameter beim Test der Funktion der 3´-UTR sind. Die 3´-UTR stimuliert die Translation nur dann, wenn monocistronische Reporter-mRNAs mit einem präzisen, authentischen 3´-Ende der 3´-UTR verwendet werden. Diese Stimulation ist stärker in Zelllinien, die von Leberzellen abgeleitet sind, als in anderen Zelllinien. In der 3´-UTR sind die Variable Region, der poly(U/C)-Trakt und der am weitesten 3´-terminal gelegene Stem-Loop 1 der hoch-konservierten 3´-X-Region für die Stimulation wichtig, weniger aber die Stem-Loops 2 und 3. Die Signale für die Stimulation der Translation überlappen also zum Teil mit denen für die Initiation der RNA-Minusstrang-Synthese, so dass diese Sequenzen möglicherweise zusammen mit viralen und/oder zellulären Proteinen an einer Interaktion der 5´- und 3´-Enden des viralen Genoms und einer Umschaltung von der Translation zur RNA-Minusstrang-Synthese beteiligt sind.

Die Suche nach Proteinen, die an der Translations-Initiation von HCV beteiligt sind, ergab zunächst kein neues Protein, das an die HCV IRES bindet. Aufgrund des Befundes dieser Arbeit, dass die 3´-UTR die Translation stimuliert, wurde dann eine Regulation der Translation auch durch Proteine, die an die 3´-UTR binden, erwogen. Deshalb wurde das Design der Reporter-Konstrukte überdacht, mit dem Resultat, dass ein bisher unbekanntes Protein entdeckt wurde, das spezifisch an die HCV-RNA bindet. Dieses 210 kDa-Protein bindet an die Variable Region der 3´-UTR nur dann, wenn eine RNA mit einem authentischen 3´-Ende der 3´-UTR verwendet wird. Dies legt die Vermutung nahe, dass das 210 kDa-Protein möglicher¬weise im Zusammen¬hang mit der Termination der Translation an die HCV-RNA oder an das Ribosom bindet und an der Umschaltung von der Translation zur RNA-Minusstrang-Synthese beteiligt ist.