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Evaluation ausgewählter Angiogenese-Inhibitoren in einem in vitro Modell der Angiogenese

Evaluation of selected inhibitors of Angiogenesis in an in vitro model of angiogenesis

Wiechmann, Klaus Dieter


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 29.03.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Der Verlauf vieler Erkrankungen (z.B. koronare Herzkrankheit, Diabetes mellitus,Tumoren, rheumatoide Arthritis) wird durch Angiogenese entscheidend
beeinflusst. Valide Angiogenese-Modelle sind eine Voraussetzung zur
Erforschung angiogener Mechanismen und zur Entwicklung angiogener und
antiangiogener Substanzen.

In der vorliegenden Arbeit gelingt die Etablierung eines Mikroshären-gestützten 'Sprouting' Assays (SpA) durch Verwendung boviner retinaler Endothelzellen (BREC). Dieser SpA wird als gut definierter und in der Durchführung einfacher Angiogenese-Assay vorgestellt, der viele Teilschritte physiologischer Angiogenese erfasst.

Zunehmend wird die Bedeutung der Dimensionalität von Angiogenese-Assays
erkannt. Als primär 3-D in vitro Modell kommt der BREC-SpA physiologisch 3-
D ablaufender Angiogenese sehr nahe. Dabei kann der BREC-SpA insbesondere
auch als Modell für retinale Neovaskularisationen dienen.

bFGF und VEGF sind verantwortlich für die Angiogenese-Induktion im BRECSpA.
TNF-alpha bleibt im gezeigten Angiogenese-Kontext ohne Wirkung.

Erhöhung der Fibrinogen-Konzentration innerhalb physiologischer Werte hat
einen antiangiogenen Effekt im BREC-SpA.

Thrombin wirkt in höheren Konzentration angiogen bei Zugabe ins Medium. Der
Effekt von 'Medium-Thrombin' ist wohl matrixunabhängig und vermutlich
direkten Wirkungen auf die Endothelzelle zuzuschreiben.

Aprotinin ist im BREC-SpA ohne angioregulatorische Wirkung und daher
redundant.

Der pH-Wert ist eine wichtiger Angiogenese-regulierender Faktor.

Die komplette Applikation von Testsubstanzen ins Versuchsmedium führt zur
methodischen Vereinfachung des BREC-SpA und vermindert das Risiko
unspezifischer Effekte durch (z.B.) pH-bedingte Veränderungen der
Matrixstruktur.

ECGF/H ist ein potenter angiogener Faktor (aF) im BREC-SpA. ECGF/H
bewirkt teilweise nicht quantifizierbare Sp und sollte daher nicht als
Standardsubstanz im BREC-SpA verwendet werden.

Die Produktion von Angiostatin (AS) durch uPA-Proteolyse von Plasminogen
(Plg) und Reduktion von Plasmin durch Sulfhydrylgruppen-Donatoren (SHD) ist
reproduzierbar.

Im Vergleich mit Plg-Proteolyse durch Elastase ergibt uPA/SHD-AS-Herstellung
eine AS-Variante, die sowohl elektrophoretisch wie auch durch N-terminale
Sequenzierung unterschieden werden kann.

cRGD und TGF-beta1 sind potente Angiogenese-Inhibitoren (AI) im BREC-SpA
und können als Kontrollsubstanzen zum Screening nach neuen AI fungieren.

TGF-beta1 zeigt seine AI-Potenz abhängig vom aF und dient als Beispiel für die Kontext-Abhängigkeit von Angiogenese.

AS und Endostatin sind im BREC-SpA und in Proliferationsassays mit BREC
und humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) ohne antiangiogene
Wirkung. Die Ursache der in diesem Kontext fehlenden Wirksamkeit ist unklar.

Das in dieser Arbeit vorgestellte Angiogenese-Modell und die dargestellten
Substanzwirkungen leisten einen Beitrag zur Erforschung der angiogenen
Mechanismen und Faktoren. Die komplexen Interaktionen im 'Angiogenese-
Kontext' müssen weiter intensiv untersucht werden, dafür bietet der BREC-SpA
ausgezeichnete Voraussetzungen.
Kurzfassung auf Englisch: The course of many diseases (for example ischaemic heart disease, diabetes
mellitus, tumors and rheumatoid arthritis) are affected critically by Angiogenesis.

Valid models of Angiogenesis are a prerequisite for research on angiogenic
mechanisms and for the development of angiogenic and antiangiogenic
substances.

This paper describes the establishment of a microcarrier-based sprouting assay
(SpA) by using bovine retinal endothelial cells (BREC). This angiogenesis assay
represents a well defined system, which is characterized by its technical simplicity
and which includes many steps that take place in physiological Angiogenesis.

Researchers focus increasingly on the dimensionality of Angiogenesis assays. As a primarily three dimensional in vitro assay the BREC-SpA closely relates to three
dimensionally occurring physiological Angiogenesis. The BREC-SpA can
especially serve as a model for retinal neovascularization.

bFGF and VEGF promote Angiogenesis in the BREC-SpA. TNF-alpha does not
effect Angiogenesis in this context.

An increase of Fibrinogen concentrations within physiological range results in an
antiangiogenic response in the BREC-SpA.

Thrombin promotes Angiogenesis in higher concentrations when added to the
cell medium. The angiogenic effect of Thrombin in the medium seems to be
independent of the matrix and probably is due to direct effects on the endothelial
cells.

Since Aprotinin does not have any effect on Angiogenesis it is redundant in the
BREC-SpA.

The pH is important in regulation of Angiogenesis.

The complete application of test substances into the assay medium results in a
methodic simplification.Also, it decreases the risk of unspecific effects caused by
modifications of matrix structure, for example due to pH effects.

ECGF/H is a potent angiogenic factor in the BREC-SpA. Since ECGF/H
partially leads to the development of sprouts that can not be quantified it should
not be used as a routine substance in the BREC-SpA.

Production of Angiostatin by proteolysis of Plasminogen by uPa and reduction of
Plasmin by Sulfhydrylgroup donators (SHD) is a reproducible method.

Compared to proteolysis of Plasminogen by Elastase the method using uPA and
SHD generates an Angiostatin form that can be distinguished by electrophoresis
as well as by N-terminal sequencing.

cRGD and TGF-beta1 act as potent Angiogenesis inhibitors in the BREC-SpA.
Therefore these substances can be used as a control when screening for new
Angiogenesis inhibitors.

The antiangiogenic potential of TGF-beta1 depends on the applied angiogenic
factor and therefore serves as an example for contextual dependency of
Angiogenesis.

Angiostatin and Endostatin do neither show any antiangiogenic effect in the
BREC-SpA nor in proliferation assays with BREC and HUVEC. The cause of
their lacking potential in this context is not known.

The Angiogenesis model presented in this work as well as the demonstrated
effects of substances contribute to the research of angiogenic mechanism and
angiogenic factors. The BREC-SpA provides excellent conditions for further
research on the complex interactions of the context of Angiogenesis, which
need to be investigated more thoroughly.