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Untersuchungen am methylgerichteten mismatch-Reparatursystem MutHLS von E. coli zur Identifizierung der Verbindung zwischen mismatch-Erkennung und Strangdiskriminierung

Thomas, Evangelos


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Mismatch-Reparatur , MutHLS , Strangdiskriminierung
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.02.2006
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 13.03.2006
Kurzfassung auf Deutsch: Im Zuge dieser Dissertation wurden einzelne Aspekte des postreplikativen mismatch
Reparatur Systems von E. coli (MutHLS) mittels biochemischer und molekularbiologischer
Methoden untersucht, um die spezifischen Abläufe dieses Prozesses genauer charakterisieren
zu können. Besonderer Fokus lag dabei auf die Reaktionen, die zwischen dem Schritt der
mismatch-Erkennung und dem der Strangdiskriminierung erfolgen. Durch die Verwendung
eines eigens kreierten Testsystems sollten die dabei vorhandenen kritischen
Versuchsparameter des MutHLS-Systems identifiziert und gleichzeitig mit den gefundenen
Daten ein mögliches Modell für diesen Mechanismus vorgestellt werden.
Bei den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bei niedrigen KCl-Konzentration eine
mismatch-unabhängigen Nebenreaktion von MutHL erfolgt, die der eigentlichen
Hauptreaktion von MutHLS aufgelagert ist. Diese Nebenreaktion kann durch die Verwendung
hoher Salzkonzentrationen (> 125 mM) nahezu vollständig unterdrückt werden. Ein weiterer
wichtiger Parameter der identifiziert werden konnte, ist beim DNA-Substrat die vorhandene
Distanz zwischen der d(GATC)-Sequenz zum DNA-Ende. Die Effizienz der Spaltreaktion
wird mit kleiner werdendem Abstand zum Ende deutlich reduziert. Der Einfluss auf die die
MutHLS-Reaktion ist dabei deutlich höher als auf die Nebenreaktion von MutHL.
Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass MutS während der Strandiskriminierungsreaktion
von MutH nicht am mismatch gebunden vorliegt, anders als es breits in
verschiedenen Publikationen beschrieben wird. Eine d(GATC)-Stelle, die so dicht am
mismatch liegt, dass sie von einem gebundenen MutS bedeckt wurde, konnte trotz dieser
Nähe in einer mismatch-abhängigen Weise geschnitten werden. Der Stimulus für diese
Spaltung kommt dabei nachgewiesenerweise vom gleichen DNA-Molekül (in cis) und nicht
von einem anderen aus (in trans), wie es bei dieser Art des Mechanismus möglich wäre.
Durch weiterführende Experimente liess sich nachweisen, dass eine Blockade auf der DNA
zwischen mismatch und d(GATC)-Sequenz, kein Hindernis für die
Strangdiskriminierungsreaktion darstellt. Damit kann ein Mechanismus bei dem MutSL auf
der DNA gleitend den Kontakt zu MutH herstellen (sliding clamp-Modell) ausgeschlossen
werden. Die in dieser Arbeit gefundenen Resultate unterstützen vielmehr einen 'looping'-
Mechanismus, bei dem der Kontakt zwischen MutSL und der d(GATC)-Spaltstelle über eine
Schleifenbildung der DNA ermöglicht wird. Aber anders als dieser Mechanismus bisher
beschrieben wurde, bleibt MutS während der Reaktion nicht am mismatch gebunden.