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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2005/2272/


Charakterisierung der Desmoglein 1-vermittelten Adhäsion und ihre Beeinflussung durch Autoantikörper bei Pemphigus foliaceus

Characterization of the desmoglein 1-mediated adhesion and its manipulation by autoantibodies in pemphigus foliaceus

Bruggeman, Paola


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Pemphigus foliaceus , Desmoglein 1 , Autoantikörper , Adhäsion , Cadherin
Freie Schlagwörter (Englisch): Pemphigus foliaceus , desmoglein 1 , autoantibody , adhesion , cadherin
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie; Institut für Anatomie und Zellbiologie der Julius-Maximillians-Universität Würzburg
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.07.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 11.08.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Die blasenbildende Hauterkrankung Pemphigus foliaceus (PF) ist durch Bildung von Autoantikörpern gegen Desmoglein 1 (Dsg 1), ein desmosomales Adhäsionsprotein der Cadherin-Familie, bedingt. Die Charakterisierung der molekularen Bindungseigenschaften desmosomaler Cadherine ist daher von besonderer klinischer Bedeutung. Zur Untersuchung der Adhäsionsstärke und Ca2+-Abhängigkeit der Dsg 1-Bindung diente ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von Dsg 1 und dem Fc-Teil eines humanen IgG (Dsg 1-Fc). Einzelmolekül-Kraftmessungen mit dem Atomkraftmikroskop (AFM) zeigten, dass die Stärke der homophilen Dsg 1-Bindung mit Abrisskräften von ~ 37-68 pN (bei Zuggeschwindigkeiten von 300–6000 nm/s) in etwa denen anderer Cadherine entspricht. Bei höheren Zuggeschwindigkeiten und konstanter Interaktionszeit traten vermehrt Bindungsereignisse mit einem Vielfachen dieser ermittelten Kräfte auf. Das Abrissmuster der gemessenen Interaktionen deutet darauf hin, dass Mehrfachbindungen vorliegen. Zusätzliche Ergebnisse aus Messungen eines einzelnen transinteragierenden Moleküls bekräftigen die Vermutung, dass die Dsg 1-Moleküle sich mit mehreren Abschnitten überlappen und dass daraus multiple Abrissereignisse resultieren.

Die Untersuchungen der Ca2+-Abhängigkeit der homophilen Dsg 1-Bindung mit dem AFM ergaben eine KD von 0,79 mM Ca2+ mit hoher Kooperativität (Hill Koeffizient > 4,0). Dagegen zeigten Messungen mit der Laserpinzette, bei denen die Anzahl der gebundenen mit Dsg 1 beschichteten Mikroperlen auf humanen Keratinozyten (HaCaT) bestimmt werden, eine deutlich höhere KD (1,6 mM Ca2+) bei vergleichbarer Kooperativität. Der Unterschied zu den AFM-Ergebnissen ist möglicherweise auf Effekte der multivalenten Bindungen oder auf heterophile Interaktionen von Dsg 1 mit anderen Desmocadherinen auf der Oberfläche der HaCaT-Zellen zurückzuführen.

Für die Entstehung von Hautblasen durch Dsg 1-Autoantikörper werden derzeit zwei Theorien diskutiert. Die eine geht davon aus, dass durch direkte sterische Blockierung der Dsg 1-vermittelten Adhäsion die Epithelzellen dissoziieren mit nachfolgender Blasenbildung. Die zweite Theorie postuliert, dass durch die Bindung von Autoantikörpern an den extrazellulären Abschnitt von Dsg 1 Signalwege in der Zelle ausgelöst werden, die zu Adhäsionsverlust und Blasenbildung führen.

Durch AFM und Laserpinzette wurde der Einfluss von Dsg 1-Autoantikörpern auf die durch Dsg 1 vermittelte Adhäsion untersucht. AFM-Messungen ergaben, dass PF-IgG-Fraktionen aus Seren von PF-Patienten die Dsg 1-Adhäsion nicht reduzierten. Wohingegen die Dsg 1-vermittelte Bindung durch einen inhibitorischen monoklonalen Antikörper gegen die externe Domäne von Dsg 1 gehemmt wurde.

Dagegen zeigten Laserpinzetten-Experimente an Zellkulturen, die mit Antikörpern inkubiert wurden, dass nicht nur der inhibitorische monoklonale Antikörper, sondern auch die PF-IgG-Fraktionen die Dsg 1-Bindung an endogenes Dsg 1 auf der Oberfläche der kultivierten Keratinozyten hemmten. Um zu untersuchen, ob für diese Hemmung der Dsg 1-Bindung zellabhängige Signalwege verantwortlich waren, wurden Mikroperlen bzw. Zellen mit PF-IgG vorinkubiert. Präinkubation der Keratinozyten mit PF-IgG führte zu einer starken Reduktion der Dsg 1-Adhäsion, Präinkubation der Mikroperlen mit PF-IgG hemmte die Bindung dagegen nicht.

Inkubationen von HaCaT-Kulturen mit PF-IgG (24 h) führten zu interzellulärer Lückenbildung in HaCaT-Kulturen. Die Lücken wurden von dünnen zytoplasmatischen Ausläufern überspannt, in denen Dsg 3 und das zytoskeletale Adapterprotein Plakoglobin nachweisbar waren. Die Dsg 1
-Immunfärbung der Keratinozyten war nach PF-IgG-Inkubation insgesamt stark verringert. Diese durch PF-IgG verursachte Dissoziation der HaCaT-Zellen konnte durch Immunabsorption des Serums mit Dsg 1-beschichteten Mikroperlen verhindert werden. Inkubationen der HaCaT-Kulturen mit dem monoklonalen Dsg 1-Antikörper (24 h) lösten keine Lückenbildung aus.

Diese Experimente zeigen, dass PF-IgG die Dissoziation von Keratinozyten und die Reduktion der durch Dsg 1 vermittelten Adhäsion nicht direkt sterisch durch Blockierung der Bindung bewirkt. Dagegen scheinen durch Autoantikörper-Bindung ausgelöste zellabhängige Signalwege zu einer Reduktion der Zell-Zell-Haftung und zur Ausbildung des Pemphigus foliaceus-Phänotyps zu führen.
Kurzfassung auf Englisch: The autoimmune blistering skin disease pemphigus foliaceus (PF) is characterized by formation of autoantibodies against desmoglein1 (Dsg 1), a member of the cadherin superfamily found in desmosomes. Therefore characterization of the molecular mechanisms of Dsg 1-binding is of particular interest. To study the binding activity and calcium-dependency of the Dsg 1-mediated binding, a Dsg 1-Fc fusion protein was used. AFM-studies revealed that the binding activity of the homophilic Dsg 1 Transinteraction was about 37-68 pN (pulling velocity 300-6000 nm/s). This was similar to the binding activities of other members of the cadherin-family. Higher order unbinding forces increased with higher pulling velocities at constant interaction times. The unbinding pattern of the measured Dsg 1-interactions indicates multiple binding events. The results of measurements with one Dsg 1-molecule interacting with Dsg 1 affirmed these observations and indicate that the measured interactions are the result of overlap with multiple unbinding events. The Ca2+ dependency of Dsg 1 transinteraction was determined by two approaches, AFM and laser tweezer assay. The AFM studies measured binding activity of single molecules in a cell-free system, laser tweezer assays showed transinteraction of recombinant Dsg 1 with endogenous Dsg 1 expressed on the surface of cultured HaCaT-cells. The AFM studies revealed a pronounced cooperativity of Dsg 1-binding with a Hill coefficient > 4.0 and a Ca2+-dependency of binding with an apparent KD of 0.79 mM Ca2+. However, Ca2+ dependency of the binding of beads coated with Dsg 1 to cultured keratinocytes displayed an apparent KD of 1.6 mM Ca2+ but the same Hill coefficient of 4.0. The difference in Ca2+-dependency of binding obtained by laser tweezer assay and AFM may be explained by possible heterophilic transinteractions of Dsg 1-coated beads with the other desmocadherins of HaCaT cells.

Previous studies demonstrated that Dsg 1 antibodies in serum of PF patients are causative for PF pathogenesis. However, how Dsg 1-antibodies induce formation of epidermal blistering is unknown. At the moment two theories are discussed. It is possible that Dsg 1-mediated binding is inhibited by PF-IgG by steric hindrance. The other theory proposes that intercellular pathways are responsible for loss of Dsg 1 binding.

In this study PF-IgG did not interfere with homophilic transinteraction of recombinant Dsg 1 probed by atomic force microscopy, whereas an inhibitory monoclonal antibody abolished binding activity in this assay.
In contrast to transinteraction of single Dsg 1 molecules, cellular adhesion of Dsg 1-coated microspheres was inhibited by both PF-IgG and the monoclonal Dsg 1 antibody. However, pre-incubation of cells but not of beads with PF-IgG, resulted reduction of Dsg 1-mediated adhesion. When cultured human keratinocytes were incubated with PF-IgG for 24 h immunofluorescence staining revealed cell dissociation and loss of Dsg 1. In contrast, the inhibitory monoclonal Dsg 1 antibody did not affect monolayer integrity. By immunodepletion of Dsg 1 autoantibodies from the PF-IgG-fraction the disrupting effects of PF-IgG on keratinocytes were abolished showing that specific antibodies against Dsg 1 were responsible for these pathogenic activities.

These results indicate that PF-IgG reduce desmoglein-mediated adhesion by mechanisms other than steric hindrance. More likely, cellular signalling pathways are necessary for skin blistering and cell dissociation.