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Exotoxin-Schock, ausgelöst durch Staphylococcus aureus alpha-Toxin, am Tiermodell Ratte : Auswirkungen auf Gefäßendothel, Leukozytenakkumulation und Thrombozytenaggregation

Wegner, Judith


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Freie Schlagwörter (Deutsch): alpha-Toxin , Schock , Sepsis
Freie Schlagwörter (Englisch): alpha-toxin , shock , sepsis
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Innere Medizin der Johannes-Gutenberg-Universität Mainz, eingereicht über das Institut für Veterinärpathologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2005
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 30.06.2005
Kurzfassung auf Deutsch: 1. Im Literaturteil wird ein Überblick über Vorkommen, Klinik und Pathogenese der Sepsis gegeben. Besonders berücksichtigt wird das durch Staphylococcus aureus alpha-Toxin-induzierte SIRS (systemic inflammatory response syndrome) als Modell für eine Sepsis durch alpha-Toxin-bildende Staphylococcus aureus-Stämme.

Weitere Schwerpunkte bilden die Interaktionen von Endothelzellen und neutrophilen Granulozyten sowie die Thrombozytenaggregation und die Auswirkungen von alpha-Toxin auf diese Mechanismen.


2. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Auswirkung verschiedener alpha-Toxin-Dosierungen (20 und 40 µg alpha-Toxin pro kg Körpergewicht) an einem Tiermodell mit Sprague Dawley Ratten untersucht. In vivo wurde über eine Beobachtungszeit von 4 Stunden alle 20 Minuten Herzfrequenz, mittlerer arterieller Blutdruck und Pressure Rate Index aufgezeichnet und stündlich der Hämatokrit bestimmt. Im Blutserum, gewonnen vor Toxingabe und am Ende der Beobachtungszeit, wurde eine Bestimmung der Zytokine TNF-alpha, IL-1beta und IL-6 durchgeführt. In Herz, Lunge und Darm wurde die Myeloperoxidaseaktivität bestimmt. Außerdem wurden von den entnommenen Organen Gefrierschnitte angefertigt. Mithilfe der H.E.-Färbung wurden die morphologischen Veränderungen an den Herzen untersucht. Um einen vergleichenden Überblick über die Expression von Adhäsionsmolekülen (P-Selektin und ICAM-1) und der NO-Synthasen (eNOS und iNOS) zu erhalten, wurde eine Immunperoxidasefärbung von Herz, Lunge und Darm angefertigt. Die NO-Synthasen wurden zusätzlich im Western-Blot bestimmt.


3. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mithilfe einer nephelometrischen Relativmessung die inhibitorische Auswirkung von Iloprost, Sin-1(Molsidomin), Indomethacin und Reo-Pro (Abciximab) auf die alpha-Toxin-induzierte Aggregation humaner Thrombozyten untersucht.


4. Die Ratten, die 40 µg alpha-Toxin pro kg Körpergewicht erhalten hatten, zeigten in vivo im Gegensatz zu denen mit der geringeren Dosis (20 µg/kg KG) deutliche Anzeichen einer SIRS mit z.T. sehr kurzer Überlebenszeit. Erhöhte MPO-gehalte bei den Tieren, die alpha-Toxin erhalten hatten, wiesen auf eine vermehrte PMN-Infiltration in Herz, Lunge und Darm hin. Diese konnte allerdings morphologisch auch nach histochemischer Darstellung der Granulozyten mittels N-ASD-C-Färbung nicht bestätigt werden. Morphologische Veränderungen am Herzen (Nekrosen) waren bei allen toxinbehandelten Tieren vorhanden, bei denen mit längerer Überlebenszeit jedoch ausgeprägter. Bei den Toxintieren konnte eine im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte Expression von P-Selektin und ICAM-1 festgestellt werden. Weder der Zytokingehalt im Serum noch die NO-Synthasen wiesen bei den Ratten, die alpha-Toxin erhalten hatten, eine Veränderung gegenüber den Kontrolltieren auf.


5. Alpha-Toxin löst bei Ratten in einer Dosierung von 40 µg pro kg Körpergewicht ein SIRS aus und kann durch direkte Effekte auf Coronargefäßen und Myokard einen sehr schnellen Tod durch Herzversagen herbeiführen. Bei einer Dosierung von 20 µg pro kg Körpergewicht werden in vivo keine Anzeichen einer SIRS und in der Histologie starke Myokardnekrosen beobachtet. Der Verlauf ist schleichender, so daß sich langsamer entwicklende Veränderungen manifest werden können.


6. Mit alpha-Toxin in einer effektiven Dosis von ca. 3,5 µg pro ml konnte eine Aggregation humaner Thrombozyten herbeigeführt werden. Keiner der eingesetzten Inhibitoren konnte die alpha-Toxin-induzierte Thrombozytenaggregation vollständig hemmen. ReoPro, Iloprost und Sin-1 führten auch in sehr hohen Dosierungen nur zu einer schwachen Aggregationshemmung. Indomethacin hatte keinen inhibitorischen Effekt.


7. Alpha-Toxin bewirkt durch Porenbildung in der Zellmembran einen extrem starken Ca2+-Einstrom aus dem Extrazellulärraum. Aus diesem Grund können Inhibitoren, die über 'second messenger' Systeme das intrazelluläre Ca2+ senken (Prostaglandinanalogon Iloprost, NO-Donor Sin-1), die alpha-Toxin-induzierte Thrombozytenaggregation nur unwesentlich hemmen.
Die alpha-Toxin-induzierte Thrombozytenaggregation ist nicht auf das Feedback durch Thromboxan (dieses entsteht auf dem Zyklooxygenaseweg) angewiesen. Deshalb sind Zyklooxygenaseinhibitoren wie Indomethacin in diesem Fall unwirksam.
Warum ReoPro als GPIIb/IIIa-Rezeptor-Blocker, keine Wirkung zeigt ist mit bisherigem Wissen nicht zu erklären.
Kurzfassung auf Englisch: 1. In the literature section an overview is given of incidence, clinical signs and pathogenesis of sepsis. Particular attention is paid to SIRS (systemic inflammatory response syndrome) induced by the staphylococcus aureus alpha-toxin as a model for sepsis caused by alpha-toxin forming strains of staphylococcus aureus.
Other main focuses are the interaction of endothelial cells and neutrophil granulocytes, as well as platelet aggregation and the effects of alpha-toxin on these mechanisms.


2. In the first section of the thesis the effect of various dosages of alpha-toxin (20 and 40 µg alpha-toxin per kg body weight) on an animal model were investigated using Sprague Dawley rats. Over an observation period of 4 hours in vivo heart rate, mean arterial blood pressure and pressure rate index were recorded every 20 minutes and haematocrit level determined hourly. The level of cytokines, TNF-alpha, IL-1beta and IL-6 were measured in blood serum taken before administration of the toxin and at the end of the observation period. Myeloperoxidase activity was measured in heart, lung and intestines. In addition, frozen sections of the removed organs were prepared. HE staining was used to determine morphological changes of the heart. In order to obtain a comparable overview of the expression of adhesion molecules (P-selectin and ICAM-1) and NO-synthases (eNOS and iNOS), an immunoperoxidase staining of heart, lung and intestines was performed. NO-synthases were also demonstrated using western blotting.


3. In the second section of the thesis the inhibiting effect of Iloprost, SIN-1 (molsidomin), Indomethacin and Reo-Pro (abciximab) on the alpha-toxin induced aggregation of human platelets was investigated using relative nephelometric measurements.


4. The rats who were given 40 µg alpha-toxin per kg body weight showed clear signs of SIRS in vivo, unlike those given the lower toxin dose (20 µg per kg body weight), and, in some, survival time was very limited. Increased levels of MPO in the animals given alpha-toxin indicated increased PMN infiltration of heart, lung and intestines. It was, however, not possible to obtain morphological confirmation of this, even by histochemical depiction of the granulocytes using N-ASD-C-staining. Morphological changes to the heart (necrosis) were to be seen in all animals given the toxin, but were more extensive in those with a longer survival time. Compared to the control group, the toxin animals were found to have increased expression of P-selectin and ICAM-1. There was no change either in the cytokine level in the serum or the NO-synthases of the rats who received the alpha-toxin in comparison to the control animals.


5. Alpha-toxin causes SIRS in rats at a dosage of 40 µg per kg body weight and can, in the case of direct effects on coronary vessels and the myocardium, lead to very rapid death through heart failure. At a dosage of 20 µg per kg body weight there is no indication of SIRS in vivo and histology shows major myocardial necrosis. The onset is more insidious so that changes which develop more slowly can manifest themselves.


6. With alpha-toxin at an effective dose of approximate 3.5 µg per ml, it was possible to induce an aggregation of human platelets. None of the inhibitors used were able to completely stop the alpha-toxin induced platelet aggregation. Even very high dosages of ReoPro, Iloprost and SIN-1 only resulted in minor inhibition of aggregation. Indomethacin had no inhibiting effect.


7. Alpha-toxin causes an extremely powerful influx of Ca2+ from the extracellular space due to the formation of pores in the cell membrane. For this reason, inhibitors which reduce intracellular Ca2+ via 'second messenger' systems (prostaglandin analogon Iloprost, NO-donor SIN-1) are able to achieve only insignificant restriction of alpha-toxin induced platelet aggregation.
The alpha-toxin induced platelet aggregation is not reliant on the feedback of thromboxane (this is produced in the cyclooxigenase pathway). This is the reason that cyclooxigenase inhibitors such as Indomethacin are not effective here.
No explanation can be given on the current state of knowledge as to why ReoPro, which, is a GPIIb/IIIa-receptor-blocker, has no effect on platelet aggregation as a result of alpha-toxin.