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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-20827
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2005/2082/


Etablierung und Charakterisierung eines in vivo RNA-Rekombinationssystems : Mechanistische Studien und Erzeugung rekombinanter Pestiviren

Gallei, Andreas


Originalveröffentlichung: (2005) Wettenberg : VVB Laufersweiler 2005
pdf-Format: Dokument 1.pdf (4.884 KB)

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-89687-449-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2005
Erstellungsjahr: 2005
Publikationsdatum: 08.04.2005
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen dieser Arbeit konnte das erste Zellkultursystem für die pestivirale RNA-Rekombination etabliert werden. Es stellt im Vergleich zur alleinigen Sequenzanalyse natürlich entstandener rekombinanter Pestivirusgenome einen erheblichen Fortschritt dar. Das System erlaubt nach Transfektion eines nicht replikationskompetenten Transkripts in mit nichtzytopathogenem (nzp) Virus infizierte Zellen und auch nach Kotransfektion von zwei synthetischen RNAs in nicht infizierte Zellen die effiziente Generierung rekombinanter Pestiviren.

Dieser Versuchsansatz ahmt in Zellkultur die Entstehung von zytopathogenen (zp) Genomen des Virus der bovinen viralen Diarrhöe (BVDV) im Tier nach. Er erlaubte es, bereits zuvor aufgestellte Arbeitshypothesen wie die Abhängigkeit der RNA-Rekombinationsfrequenz von der zur Verfügung stehenden Menge eines Rekombinationspartners zu bestätigen. Ausserdem zeigte die Analyse von 46 „crossover“-Regionen, die jeweils durch Rekombination zwischen demselben Paar von parentalen RNAs entstanden waren, eine mögliche Beteiligung von Basenpaarung an einem hypothetischen, replikativen Rekombinationsprozess. Dabei konnte unter anderem das bislang größte pestivirale Genom identifiziert werden, dessen Länge die eines nzp Virus um fast 60 % übertrifft.

Weitere Untersuchungen zum Mechanismus der RNA-Rekombination deuteten darauf hin, dass zumindest in diesem System RNA-Rekombination hauptsächlich in den ersten Stunden nach der Transfektion synthetischer RNAs stattfand. Desweiteren scheint replikative RNA-Rekombination von Pestiviren nicht (oder nur sehr eingeschränkt) während der viralen Plusstrangsynthese stattzufinden. Es konnte auch gezeigt werden, dass der pestivirale Replikationskomplex die Plusstrangsynthese am 3´-Ende eines (synthetischen) Minusstrangs in trans nicht initiieren kann.

Die Möglichkeit zur gezielten Beeinflussung beider Rekombinationspartner erlaubte Studien, welche die Unabhängigkeit der RNA-Rekombination von der autonomen Replikationskompetenz beider Rekombinationspartner beweisen. Dabei konnten einzigartige rekombinante nzp BVD-Viren isoliert werden. Über die Bestimmung der Herkunft der 3´NTR rekombinanter viraler Genome wurde für das Rekombinationssystem ein doppelter 'template switch' zwischen den eingesetzten Rekombinationspartnern während der viralen Minusstrangsynthese ausgeschlossen. Als wichtigstes Ergebnis belegen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Versuche, dass in der Zelle ein bislang nicht näher charakterisierter Mechanismus für die Rekombination von RNAs existiert, der von der Anwesenheit einer viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) unabhängig ist. Eine End- zu Endligation der beteiligten Rekombinationspartner scheint dabei keine Rolle zu spielen. Die weitreichende Bedeutung dieses Phänomens für die Evolution und Zellbiologie ist noch nicht abzusehen.

Das Rekombinationssystem wurde zur Klärung der Frage eingesetzt, ob die Entstehung eines von einem Helfervirus unabhängigen zp Genoms des Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) durch RNA-Rekombination möglich ist. Ein solches KSPV war bislang weder aus infizierten Tieren noch aus Zellkulturpassagen eines nzp Virus isoliert worden. Durch erfolgreiche Adaptation des Rekombinationssystems an KSPV konnte das von einem Helfervirus unabhängige zp KSPV (CP G1) erzeugt werden. Exemplarisch wurde für CP G1 gezeigt, dass Helfervirus-unabhängige zp Stämme für eine vereinfachte Durchführung von Serumneutralisationstests in der KSPV-Diagnostik geeignet erscheinen. Zusammengefasst zeigt diese praktische Anwendung, dass das vorliegende Rekombinationssystem als Alternative zum klassischen Mutationsweg über reverse Genetik ein flexibel einsetzbares Wekzeug darstellt. Dieses System kann u.a. zur Generierung rekombinanter (Pesti)-Viren von erwünschtem Phänotyp (z.B. von zp Genomen) sowie zur gezielten Mutation definierter Bereiche eines viralen Genoms (z.B. von RdRp-Mutanten) eingesetzt werden.
Kurzfassung auf Englisch: In this study the first cell culture system for RNA recombination of pestiviruses was established. It represents a considerable progress when compared to sequence analyses of naturally emerged recombinant pestiviral isolates only. This system allowed the efficient generation and subsequent characterization of recombinant pestiviral genomes after transfection of a synthetic and replication incompetent RNA into cells infected with a noncytopathogenic (noncp) virus. In addition, recombination was also observed when two synthetic transcripts were transfected into noninfected cells.

This cell culture system mimics the emergence of cytopathogenic (cp) Bovine viral diarrhea virus (BVDV) genomes within the infected animal and dependably allowed to prove hypotheses concerning RNA recombination. These findings included the correlation of RNA recombination frequency with the amount of one recombination partner. Moreover, analyses of fourtysix crossover sites each originating from recombination between the same pair of parental RNAs suggested that basepairing might have facilitated replicative template switching. Upon these analyses, the largest pestiviral genome ever described was identified which genome length exceeds that of a noncp pestivirus by almost sixty percent.

Subsequent investigations concerning the mechanism of RNA recombination suggest that, at least in this system, recombination seems to take place mainly within the first hours after the transfection of synthetic RNAs. Moreover, replicative RNA recombination of pestiviruses seems not to (or only restrictedly) occur during viral plus strand synthesis. These studies also revealed that the pestiviral replication complex is not able to initiate synthesis of plus strands at a (synthetic) pestiviral minus strand in trans.

Being given the possibility to selectively manipulate both recombination partners, additional experiments were performed that demonstrated the occurrence of RNA recombination between two replication incompetent transcripts. Thereby, unique recombinant noncp BVDV genomes could be isolated. Furthermore, by determining the origin of the viral 3´NTR of emerged recombinant genomes, for this system a double template switch during viral minus strand synthesis could be excluded. Most importantly, our studies showed that a unique, so far uncharacterized mechanism of RNA recombination exists in vivo that is independent from the presence of a functional viral RNA-dependent RNA-polymerase (RdRp). Here, an end to end ligation of RNA molecules that participate in recombination was obviously not involved. The relevance of this phenomenon for evolution and its impact on cell biology are yet to be determined.

Finally, the recombination system was used to elucidate the question, whether - although never being isolated from infected animals or cell culture passages of a noncp virus - a helper virus independent cp Classical swine fever virus (CSFV) can be generated by RNA recombination. By successful adaptation of the recombination system to CSFV the unique helper virus independent cp CSFV strain CP G1 was generated. As it was exemplarily demonstrated for CP G1, helper virus independent cp strains could facilitate accomplishment of serum neutralization assays for diagnosis of Classical swine fever. Taken together, this practical application demonstrates that, as an alternative to classical reverse genetics, the established recombination system represents a powerful und versatile tool. It is appropriate not only for generation of recombinant (pesti)viruses exhibiting a desired phenotype (e.g., cp genomes), but also for targeted mutation of defined regions of a viral genome (e.g., RdRp-mutants).