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Ouabain stimuliert Signalkaskaden und Zellproliferation in menschlichen Endothelzellen und erhöht die Expression und Freisetzung von Endothelin-1

Saunders, Robert Peter


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie und Endokrinologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 20.12.2004
Kurzfassung auf Deutsch: Ouabain ist ein neu beschriebenes Hormon des kardiovaskulären Systems. Erhöhte Spiegel dieses Hormons werden neuerdings in causalem Zusammenhang mit Hypertonie gesehen. Ouabain ist ein spezifischer Inhibitor der Natrium-Pumpe der Plasmamembran. Es wurde vermutet, dass seine Wirkung durch die Blockade der Pumpe erklärt werden konnte, wodurch die intrazellulären Natrium-Konzentrationen ansteigen und damit indirekt der Natrium-Calcium-Austauscher blockiert wird, was schlussendlich dazu führt, dass die intrazellulären Calciumspiegel ansteigen. Es wurde vermutet, dass Ouabain über diesen Weg die Kontraktionskraft des Herzens erhöht, was seine Rolle in der Therapie der Herzinsuffizienz erklärt. Die neuere Literatur enthält jedoch Hinweise darauf, dass die zirkulierenden Ouabain-Spiegel, selbst bei Hypertonie, viel zu niedrig sind, um eine Hemmung der Natrium-Pumpe zu erreichen. Es konnte gezeigt werden, dass Ouabain in Konzentrationen, in denen die Pumpe nicht gehemmt wird, eine Reihe von Calcium-abhängigen und Calcium-unabhängigen Signal-Kaskaden aktivieren kann, wobei die Natrium-Pumpe als Signal Transduktor fungiert. Unglücklicherweise wurden viele dieser Experimente an Nager-Zellen vorgenommen, die eine sehr viel stärkere Resistenz gegenüber der Natrium-Pumpe aufweisen als menschliche Zellen. Dadurch ist es sehr schwierig, die gewonnenen Ergebnisse auf die menschliche Physiologie zu übertragen.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, menschliche Gefäßendothelzellen in Kultur zu bringen, um so die mögliche Rolle von Ouabain bei der endothelialen Dysfunktion zu untersuchen, die bei essentieller Hypertonie zu beobachten ist. Weiterhin sollte untersucht werden, ob das Endothelium das mögliche Verbindungselement zwischen erhöhten Ouabain-Spiegeln und essentieller Hypertonie ist. Aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit wurden menschliche Nabelschnurarterien-Endothelzellen (HUAEC) für die Experimente in Kultur gebracht. Im Verlauf der Arbeit wurden die Effekte von physiologischen Konzentrationen von Ouabain auf grundlegende Funktionen des Endothels untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass niedrige Konzentrationen von Ouabain die Proliferation des Endothels um 49 % ± 7,5 erhöhten und erstaunlicherweise auch eine 39, 7 ± 14,2 % ige Erhöhung der Natrium-Pumpe verursachten. Durch Western-Blot Analysen konnte weiterhin gezeigt werden, dass Ouabain die Phosphorylierung der MAPK ERK 1/2 um 127 % ± 11,4 erhöht, was in der Literatur in Zusammenhang mit einer Aktivierung von AP-1 gesehen wird. Ouabain stimuliert ebenfalls sog. „Calciumtransiente“, die NF-κB aktivieren, was durch eine [Ca2+] Messung mit Hilfe von Fura-2 bestätigt werden konnte. Die Ergebnisse der semiquantitativen PCR zeigten eine Ouabain-abhängige Steigerung der ET-1 Gentranskription. Das ET-1 Gen trägt bekanntermaßen zwei AP-1 Promotor-Sequenzen und es wird vermutet, dass es weiter „upstream“ ebenfalls eine NF-κB Promotor-Region enthält. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Ouabain innerhalb von 5 min nach Zugabe eine 97,8 ± 8,3 % ige Erhöhung (p < 0,01) des ET-1 Peptids in das Zellkulturmedium stimulierte. Es ist bekannt, dass dieser Prozess Calcium-abhängig ist, so dass sehr wahrscheinlich die Ouabain-vermittelten Calciumtransiente die Ursache für das Freisetzen sind.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum ersten Mal eine mögliche Rolle des Ouabains bei der endothelialen Dysfunktion, welche mit essentieller Hypertonie in Verbindung gebracht wird, auf. Damit lässt sich ein möglicher Mechanismus für die Rolle des Ouabains bei essentieller Hypertonie postulieren.
Kurzfassung auf Englisch: Ouabain is a newly described hormone of the cardiovascular system. Elevated levels of this hormone have recently been causally associated with essential hypertension. Ouabain is a specific inhibitor of the sodium pump of the plasma membrane, and as such it was presumed to act through its inhibitory action upon the pump to increase intracellular sodium concentrations and thereby indirectly inhibit the sodium/calcium exchanger, causing an increase in intracellular calcium. This was presumed to be the mechanism whereby ouabain, used in the treatment of cardiac failure, strengthened cardiac muscle contractions. Evidence in recent literature suggests that the circulating ouabain concentration, even in essential hypertension, is too low to generally inhibit the sodium pump. It has been shown that ouabain at non-inhibitory concentrations can activate calcium dependant and calcium independent signal cascades, using the sodium pump as a signal transducer. Unfortunately much of the available literature involves rodent cells, which are much more ouabain resistant that human cells, making the interpretation of the results for a human pathological context very difficult.

This work set out to establish human vascular endothelial cells in culture, to determine the possible role of ouabain in endothelial dysfunction, known to be associated with essential hypertension, and to examine the endothelium as the possible connection between elevated ouabain and essential hypertension. Due to the ready availability of material, human umbilical artery endothelial cells (HUAEC) were established in culture. The effects of physiological concentrations of ouabain upon basic endothelial function were examined.

The results show that low concentrations of ouabain elevated endothelial proliferation
49 % ± 7.5, and surprisingly also caused a 39.7 % ± 14.2 increase in sodium pump activity. Through western-blot measurement it could also be shown that ouabain increased MAPK ERK1/2 phosphorylation (127 % ± 11.4), associated in the literature with activation of AP-1. Ouabain also triggered calcium transients, as shown by Fura-2 measurement of [Ca2+]i, known to activate NF-κB. The results of semi-quantitative RT-PCR measurement demonstrated ouabain dependant upregulation of ET-1 gene transcription of 19.5 % ± 3.1 (p < 0.001). The ET-1 gene is known to contain 2 AP-1 promotor sequences and is also thought to contain a NF-κB promoter region further upstream. It was also shown that ouabain triggered an increase in release of ET-1 peptide into the culture medium of up to 97.8 % ± 8.3 (mean ± SEM; p < 0.01) within 5 minutes of application. This process is known to be calcium dependant, making the ouabain dependant calcium transients the most likely stimulus for release. These results demonstrate a possible role for ouabain in endothelial dysfunction associated with essential hypertension, and in doing so provides a possible mechanism for ouabains association with essential hypertension.