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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-18966
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2004/1896/


Sequenzielle Genexpressionsanalyse pro- und antiinflammatorischer Zytokine in durchflusszytometrisch aufgereinigten Alveolarmakrophagen von Patienten mit akuter respiratorischer Insuffizienz

Pavlidis, Theodoros


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Freie Schlagwörter (Deutsch): ARDS , Zytokine , Alveolarmakrophage , Durchflusszytometrie
Freie Schlagwörter (Englisch): ARDS , Cytocine , Alveolarmacrophage , Cell Sorting
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Medizinisches Zentrum für Innere Medizin, Medizinische Klinik II, Klinische Forschergruppe: Respiratorische Insuffizienz
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2004
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 08.12.2004
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurde das proinflammatorische (TNF- alpha, IL-6, IL-8, MCP-1) und antiinflammatorische (IL-1ra, IL-10) Genexpressions- und Proteinsekretionsmuster in durchflußzytometrisch hoch aufgereinigten residenten Alveolarmakrophagen, sowie in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von primär und sequentiell lavagierten septischen ARDS-Patienten untersucht und mit denen von Normalpersonen verglichen. Durch Verwendung eines neu entwickelten durchflusszytometrischen Separationsverfahrens gelang es, residente Alveolarmakrophagen ohne vorherige in vitro Anfärbung aufgrund ihrer Grössen- und Autofluoreszenscharakteristika flowzytometrisch von neutrophilen Granulozyten, welche regelhaft in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit septischer ARDS-Patienten nachzuweisen sind, sicher zu diskriminieren und hochgradig aufzureinigen. Diese Separationstechnik erlaubte die zellspezifische Analyse des pro- und antiinflammatorischen Zytokingenexpressionsprofils residenter Alveolarmakrophagen bei gesunden Probanden und septischen ARDS-Patienten mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR. In der ARDS-Gruppe wurden sequentielle Lavagen alle 3 Tage durchgeführt und die Zytokingenexpression in residenten AM im Verlauf des septischen ARDS erfasst. Die proinflammmatorischen Zytokine TNF-alpha, IL-6, IL-8 sowie MCP-1 waren hierbei in residenten Alveolarmakrophagen primär lavagierter ARDS Patienten im Vergleich zur Expression in Alveolarmakrophagen von Kontrollprobanden signifikant heraufreguliert, während das Expressionsprofil der antiinflammatorischen Zytokine IL-1ra und IL-10 im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant verändert war. Demgegenüber zeigten die AM von sekundär und tertiär lavagierten ARDS-Patienten eine im Vergleich zur primären Lavage drastisch reduzierte Genexpression proinflammatorischer Zytokine, während zugleich die Expression des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 im Verlauf deutlich zunahm. Komplementär zur Analyse des Zytokingenexpressionsprofils in aufgereinigten AM zeigte die Analyse der sezernierten pro- und antiinflammatorischen Zytokine in der BAL-Flüssigkeit sequentiell lavagierter ARDS-Patienten im Vergleich zu Kontrollprobanden initial drastisch gesteigerte proinflammatorische Zytokinspiegel, welche im Verlauf des ARDS für die meisten untersuchten Zytokine deutlich abnahmen.

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Zytokingenexpressionsanalyse hochaufgereinigter Alveolarmakrophagen sequentiell lavagierter ARDS-Patienten zeigt, dass die Genexpression pro- und antiinflammatorischer Zytokine in Alveolarmakrophagen im Verlauf des septischen ARDS differentiell reguliert wird. Während in der Frühphase des ARDS ein 'proinflammatorischer Phänotyp' der residenten Alveolarmakrophagen nachweisbar ist, dominiert in der Spätphase des septischen ARDS ein antiinflammatorisches Genexpressionsmuster dieser Zellen. Diese aus klinischem Untersuchungsmaterial gewonnenen Daten unterstützen das Konzept, dass residente Alveolarmakrophagen als professionelle Phagozyten im Kontext des septischen ARDS zwar massgeblich an der initialen proinflammatorischen Zytokinantwort mitwirken, der Aktivierungszustand im Verlauf des septischen ARDS jedoch rasch wieder herunterreguliert wird. Residente Makrophagen des Alveolarraumes sind somit potentielle Zielzellen für therapeutische Interventionsstrategien, die die initiale überschiessende Zytokinantwort antagonisieren oder die in der Folgephase supprimierte ´Host Defense` stimulieren.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the present study was to further characterize the role of alveolar macrophages (AM) in Acute Respiratory Distress Syndrom (ARDS) by evaluating their capacity to produce pro- [tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-6, IL-8, monocyte chemoattractant protein (MCP)-1] and antiinflammatory cytokines [IL-10 and IL-1 receptor antagonist (IL1ra)].

Patients with ARDS (n=15) underwent sequential bronchoalveolar lavage (BAL), whereas healthy volunteers (n=9) had a single BAL. AM were separated to high purity (>96%) using fluorescence-activated cell sorting. We determined the pro- (TNF-alpha, IL-6, IL-8, MCP-1) and anti-inflammatory (IL-10, IL-1ra) cytokine gene expression in AM ex vivo using semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Moreover, we evaluated samples of BAL fluids for the same pro- and anti-inflammatory cytokines using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

We found increased TNF-alpha, IL-6, IL-8 and MCP-1 messenger ribonuclein acid (mRNA) levels in resident AM from primary lavaged ARDS patients in comparison to the control group, whereas there was no significant difference in the low expression of IL-10 and IL-1ra between these groups. AM from secondary and tertiary lavaged ARDS patients showed a reduction of proinflammatory cytokines in comparison to the primary lavage, at the same time expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 was increased. Complementary to the cytokine gene expression profiles an initially increased secretion of proinflammatory cy-tokines was observed. Consequently, resident AM are possible target cells for therapeutic intervention strategies to suppress the exaggerated inflammatory process or stimulate the downregulated ´host defense`.