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L-Plastin in humanen T-Lymphozyten : Kostimulations-abhängige Phosphorylierung an Ser-5 und Verlagerung in die Immunologische Synapse

Wabnitz, Guido


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Kurze Beschreibung der beigefügten Filme:

Film 4.4.7.1 Zellkontakt zwischen EGFP exprimierenden PBT und RajisAg B-Zellen Humane PBT wurden mit cDNA kodiertem EGFP elektroporiert und anschließend zusammen mit RajisAg B-Zellen auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger ausgebracht. Anschließend wurde alle 18 Sekunden ein DIC- (links) und Fluoreszenz-Bild (rechts) aufgenommen. Die Fluoreszenz wurde in „Falschfarben“ visualisiert, um lokale Anreicherungen in den bewegten Zellen darzustellen (s. dazu Abb. 4.4.7). Niedrige lokale Konzentrationen erscheinen bei dieser Darstellung in blauer und grüner Farbe, während rote und weiße Farbtöne eine starke Anreicherung darstellen. In diesem Film bildeten die T-Zellen lamellopodienartige Ausstülpungen aus und die obere T-Zelle zeigt einen Kontakt mit einer RajisAg B-Zelle. Dabei wurde EGFP weder in den Membranausstülpungen noch an der Kontaktzone angereichert, was an der gleich bleibenden blau/grünen Färbung zu erkennen ist. Die Zahlen oben links geben die Zeit nach Filmstart an (Min:Sek).
Film 4.4.7.2 Zellkontakt zwischen wt-LPL exprimierenden PBT und RajisAg B-Zellen Humane wt-LPL exprimierende PBT wurden wie im Film 4.4.7.1 beschrieben mit RajisAg gemischt und TLV-Aufnahmen angefertigt. Es ist an der weiß/roten Färbung zu erkennen, dass wt-LPL direkt nach dem Kontakt zwischen T- und B-Zelle in die Kontaktzone verlagert wurde. Anschließend blieb es dort über 30 Minuten lokalisiert. Während der gesamten Zeit bewegten sich B- und T-Zellen jedoch im geringen Umfang. Dabei wurde der Kontakt jedoch nie aufgehoben. Auch wt-LPL wurde an der Kotaktzone 'hin und her' bewegt ohne aus dem Bereich der Kontaktzone zu verschwinden.
Film 4.4.7.3 Zellkontakt zwischen 5A-LPL exprimierenden PBT und RajisAg B-Zellen 5A-LPL exprimierende PBT wurden wie im Film 4.4.7.1 beschrieben gemeinsam mit RajisAg B-Zellen auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger pipettiert und mittels Time- Lapse Videomikroskopie aufgenommnen. Hier wurde ein Ausschnitt ausgewählt, in dem eine T-Zelle mit zwei B-Zellen in Kontakt trat. Es ist zu erkennen, dass 5A-LPL zunächst an den Zellpol verlagert wurde, an dem der erste Kontakt zu einer B-Zelle aufgenommen wurde. Erst anschließend kam es zum Kontakt mit einer weiteren B-Zelle und 5A-LPL wurde sofort auch an diesen Pol verlagert, so dass es an zwei Polen der T-Zelle angereichert war.
Film 4.4.8.1 Migrierende T-Zelle Neben T-Zellen, die wie in den Filmen 4.4.7.1 bis 4.4.7.3 beschrieben einen Kontakt zu B-Zellen bildeten, konnten öfters solche beobachtet werden, die eine amöboide Migration zeigten. In diesem Film ist eine migrierende Zelle gezeigt, die ständig lamellipodienartige Ausstülpungen bildete. Erkennbar an der roten Färbung wurde wt-LPL deutlich in diese Ausstülpungen verlagert.

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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Immunologie, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg; eingereicht über das Institut für Allgemeine Zoologie und Entwicklungsbiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 12.11.2004
Kurzfassung auf Deutsch: T-Zellen zirkulieren unaufhörlich durch Blutgefäße und lymphatische Systeme, um die Umgebung nach passenden Antigenen abzusuchen. Bei der Erkennung eines Antigens auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) werden an der Kontaktzone zwischen APZ und T-Zelle hoch-organisierte Proteinkluster geformt, die sich in einem äußeren Adhäsionsring und einer zentralen Aktivierungs- bzw. Effektorzone anordnen. Diese so genannte Immunologische Synapse (IS) ist maßgeblich an der Aktivierung und Funktion der T-Zellen beteiligt. Für die Reifung der IS ist Kostimulation essentiell, d.h. neben Signal 1 über den T-Zell Rezeptor (TZR) benötigt die Zelle ein zweites Signal, das über akzessorische Rezeptoren wie CD28 oder CD2 vermittelt wird. Es gibt Hinweise darauf, dass über diese Kostimulation eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts verursacht wird, die letztlich für die Ausbildung von Rezeptor-Klustern in der IS unabdingbar ist. Es ist bislang nur ein Aktin-bindendes Protein beschrieben worden, das speziell nach Kostimulation modifiziert wird und die Brücke zwischen der dynamischen Umorganisation des Aktin-Zytoskeletts und Kostimulation schlagen könnte, nämlich Cofilin. Ein weiteres Aktin-bindendes Protein, L-Plastin, wird nach mitogener CD2-Aktivierung an Serinresten phosphoryliert, nicht aber nach alleiniger TZR/CD3 Stimulation. Über die Funktion von L-Plastin bei der T-Zell-Kostimulation war bisher nichts bekannt.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob L-Plastin über Kostimulation reguliert wird und an der Reifung der IS bzw. an der Klusterbildung von Rezeptoren beteiligt ist. Zunächst wurde gezeigt, dass L-Plastin nach klassischer Kostimulation über CD2 bzw. CD28 phosphoryliert wird. Um die Rolle der L-Plastin Phosphorylierung während der T-Zell-Aktivierung genauer untersuchen zu können, wurde die Phosphorylierungsstelle von L-Plastin durch Massenspektroskopie und gerichtete Mutagenese bestimmt. Dabei ergab sich, dass Ser-5 die einzige Phosphorylierungsstelle im L-Plastin-Molekül ist. Interessanterweise zeigten PBT, die cDNA kodiertes nicht-phosphorylierbares 5A-LPL exprimierten, eine Reduktion in ihrer Funktion, gemessen an dem frühen Aktivierungsmarker CD69.
Aufgrund seiner Fähigkeit Aktin-Filamente, die für die Ausbildung einer reifen IS essentiell sind, zu bündeln, lag die Vermutung nahe, dass L-Plastin für die Bildung bzw. Stabilisierung von Rezeptor-Klustern in der IS wichtig sein könnte. Daher wurde zunächst der Frage nachgegangen, ob L-Plastin an der Klusterbildung von Rezeptoren, die durch Antikörper gegen Oberflächenmoleküle induziert wurden (Rezeptor-Caps oder Caps), beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass sich L-Plastin an dem Pol der Zelle anreicherte, an dem sich auch das Cap befand, was erstmals darauf hindeutete, dass L-Plastin tatsächlich eine Rolle in der Bildung oder Stabilisierung von Rezeptor-Klustern spielt. Um diese Vermutung zu verifizieren, wurden die Effekte von Bromo-Phenacylbromid (BPB) auf Rezeptor-Caps untersucht. BPB ist eine niedermolekulare Substanz, die in geringen Konzentrationen selektiv und kovalent an L-Plastin bindet. Die Ausbildung von Caps wurde tatsächlich durch eine Vorinkubation von PBT mit BPB um ca. 90% reduziert. Dieser Effekt war transient, d.h. 5-6 Stunden nach der Vorinkubation bildeten etwa 30% der Zellen wieder Rezeptor-Caps aus. Innerhalb dieses Zeitfensters („funktioneller Knock-out Zustand“) konnte mit cDNA exprimiertem wildtyp-L-Plastin die Bildung von Rezeptor-Caps teilweise rekonstituiert werden, wodurch eine direkte Funktion von L-Plastin an der Bildung von Rezeptor-Klustern postuliert werden kann. Eine erneute Cap-Bildung konnte auch mit einer nicht-phosphorylierbaren L-Plastin Mutante (5A-LPL) erzielt werden. Diese war aber verglichen mit der Rekonstitution über wildtyp-L-Plastin deutlich schwächer. Dieser Unterschied deutet darauf hin, dass die L-Plastin Phosphorylierung eine stabilisierende Wirkung auf die Rezeptor-Kluster ausübt.

Zusammenfassend konnte durch diese Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass das über T-Zell-Kostimulation phosphorylierbare Aktin-bündelnde Protein L-Plastin an der Bildung bzw. Stabilisierung von Rezeptor-Klustern beteiligt ist.