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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-15454
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2004/1545/


Nachweis von delta-Opioidrezeptoren auf Melanozyten der Melanomzellinie G-361

Jayasinghe, Melany


Originalveröffentlichung: (2003) FEBS Letters 480.2000, S. 156-160
pdf-Format: Dokument 1.pdf (511 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): delta Opoidrezeptor , Melanozyten
Freie Schlagwörter (Englisch): delta opioid receptor , melanocyte
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Rudolph-Buchheim-Institut für Pharmakologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.05.2004
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 01.06.2004
Kurzfassung auf Deutsch: Opioidrezeptoren und endogene Opioide werden auch als opioiderge Systeme zusammengefasst, die nach heutigen Erkenntnissen vorwiegend im zentralen und im peripheren Nervensystem vorkommen. Eine Reihe von Befunden deutet jedoch darauf hin, dass sowohl Opioide als auch ihre Rezeptoren in der Haut existieren. Hierzu zählen insbesondere die Entdeckung hochselektiver delta- Opioidrezeptorliganden (Deltorphine) in der Froschhaut (KREIL et al., 1989), die Expression von POMC, dem Precursormolekül einiger Opioidpeptide, in Keratinozyten (BHARDWAJ et al., 1994), Hinweise auf eine Freisetzung von beta-Endorphin aus Keratinozyten (WINTZEN et al., 1996), die Expression des mu-Opioidrezeptors in Keratinozyten (BIGLIARDI et al.,1998), die Entdeckung spezifischer Bindungsstellen für beta- Endorphin auf Keratinozyten(EGELING et al., 1999).

Dabei beziehen sich die heutigen Erkenntnisse im wesentlichen nur auf die Keratinozyten. Eine Interaktion anderer Hautzellen mit opioidergen Systemen wurde noch nicht eingehend untersucht. Die vorliegende Arbeit sollte der Gewinnung neuer Erkenntnisse über opioiderge Systeme in der Haut dienen und bestehende Befunde weiter aufklären beziehungsweise ergänzen. Wir entschieden uns, die Hautzellen des Pigmentsystems, die Melanozyten, für unsere Arbeit heranzuziehen, um so einen anderen Sektor der Haut in Bezug auf opioiderge Systeme zu erschließen. Aus methodischen Gründen wurden Melanomzellinien für die Versuche herangezogen. Die Melanomzellinien G-361 und COLO 679 sollten auf eine Expression von mu-, kappa- und delta- Opioidrezeptoren geprüft werden.

In der Tat konnte mittels RT- PCR die mRNA des delta-Opioidrezeptors in beiden Melanomzellinien nachgewiesen werden.

Zusätzlich zum PCR- Amplifikat des d- Opioidrezeptors wurde ein weiteres PCR- Produkt mit einer um circa 150 bp verkürzten Länge der erwarteten d-Opioidrezeptorsequenz beobachtet.

Untersuchungen von MAYER et al. (2000) deuteten darauf hin, dass in diesen Melanomzellinien weder eine Expression des mu Opioidrezeptors noch des kappa- Opioidrezeptors stattfand.

Die Existenz von Translationsprodukten, d.h. von mu-, kappa- und delta- Opioidrezeptoren auf Membranebene wurde mittels Radiorezeptor- Bindungsversuchen geprüft. Die Versuche wurden mit Membransuspensionen der Melanomzellinie G-361 unter Einsatz Tritium- markierter, hochselektiver Liganden für mu-, kappa- und delta- Opioidrezeptoren durchgeführt.

Für den selektiven delta- Opioidrezeptorliganden (3H)-DPDPE konnte eine spezifische Bindung auf Membranen der Zellinie G-361 aufgezeigt werden. Diese überschritt jedoch nicht 1% der Gesamtradioaktivität im Ansatz. Den gentechnologischen Ergebnissen entsprechend konnte weder für den mu- Opioidrezeptoragonisten (3H)-DAMGO, noch für den kappa- Opioidrezeptoragonisten (3H)-U 69 593 eine spezifische Bindung auf Melanomzellmembranen nachgewiesen werden.

Die Bindung von (3H)-DPDPE an den delta- Opioidrezeptor entsprach den klassischen Kriterien einer spezifischen Ligand- Binder- Interaktion. Mittels Radiorezeptor-Bindungsversuchen gelang die Charakterisierung dieser Bindungsstelle.

Für die Interaktion zwischen (3H)-DPDPE und den delta- Opioidrezeptor konnten zum einen die Bindungscharakteristika:, Zeitabhängigkeit, Reversibilität und Sättigbarkeit beschrieben werden. Zum anderen konnte aus Verdrängungsexperimenten eine KD berechnet werden, die eine hohe Affinität anzeigte.

In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein delta- Opioidrezeptor in der menschlichen Haut existiert. Dieses Ergebnis stellt somit einen weiteren Beweis für die Existenz opioiderger Systeme in der Haut dar.
Kurzfassung auf Englisch: Delta opioid receptors, along with mu and kappa belong to the family of neuropeptide receptors which respond to endogenous opioid peptides. They are mainly found in the central and in the peripheral nervous system. The skin appears to contain such opioidergic systems as well. Highly selective delta opioid receptor ligands called deltorphins have been detected in amphibian skin (KREIL et al., 1989) and recently the presence of opioid receptors in human keratinocytes has been reported (BIGLIARDI et al., 1998) as well as the release of beta- Endorphin from keratinocytes (WINTZEN et al., 1996). In addition, mRNA for proopiomelanocortin, the precursor of endorphins, was found in keratinocytes (BHARDWAJ et al., 1994). Furthermore non-opioid binding sites for beta- Endorphin became evident on human keratinocytes (EGELING et al., 1999).

We searched for the expression of the three opioid receptors types mu, delta and kappa in human melanocytes.

Two melanoma cell lines, G- 361 and COLO 679, were screened by RT- PCR for the presence of opioid receptor mRNA. PCR amplification of melanocyte cDNA revealed the presence of delta opioid receptor message in both melanoma cell lines. The two other classes of opioid receptors mu and kappa were absent (MAYER et al., 2000).

In the melanoma cells an additional shorter form of the wild type delta opioid receptor cDNA was detected by RT-PCR.

The presence of functional opioid receptors on pigment cells was demonstrated by radioligand binding studies. They were performed with membranes of G-361 melanoma cells, and tritium- labeled opioid agonists selective for mu, delta and kappa receptors were employed.

A highly selective delta opioid receptor ligand, (3H)- DPDPE, displayed specific binding to crude membrane preparations of G-361 cells, whereas selective mu or kappa receptor ligands (3H)- DAMGO and (3H)- U69593 did not. (3H)- DPDPE binding did not exceed 1% of the total radioactivity present in the incubates.

(3H)- DPDPE binding to the delta opioid receptor on G-361 membranes was time- dependent, reversible, and saturable. Moreover radioligand competition studies revealed a dissociation constant KD showing high- affinity.