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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2004/1463/


Antigene des Rinderkokzids Eimeria bovis auf der Oberfläche infizierter Zellen in vitro

Badawy, Ahmed


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Eimeria bovis , Rinder , Parasit , Oberflächenantigene , Kokzidia
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Parasitologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.04.2004
Erstellungsjahr: 2004
Publikationsdatum: 06.04.2004
Kurzfassung auf Deutsch: Die Arbeit befaßt sich mit dem Nachweis und der Charakterisierung von Oberflächenantigenen auf E. bovis-infizierten Zellen im Verlauf der Entwicklung des Parasiten in vitro.

Vier bovine Zelllinien, darunter 2 primäre Endothelzelllinien und VERO-Zellen wurden in vitro mit E. bovis-Sporozoiten infiziert. Eine Weiterentwicklung erfolgte nur in den Zellen vom Rind, wobei die Entwicklung in einer Linie von fetalen gastrointestinalen Zellen (BFGC) am besten war, indem sich dort die größten und Merozoiten-reichsten Schizonten entwickelten. In VERO-Zellen kam es zwar zu keiner Schizogonie, aber die Sporozoiten überlebten für mehrere Wochen.

In rasterelektronenmikroskopischen Studien an E. bovis-infizierten Endothelzellen wurden die Größenzunahme der Wirtszelle und Veränderungen ihrer Oberflächenstruktur im Verlauf der Entwicklung des Parasiten verfolgt. Die Oberfläche infizierter Zellen nach Abschluß der Schizogonie erwies sich als uneinheitlich, indem teils knötchen- oder blasenartige, teils villus- oder haarförmige Strukturen auftraten.

Infizierte, mit 4% Paraformaldehyd/0.25% Glutaraldehyd (PAGA) fixierte Wirtszellen banden ab dem 7. Tag p. i. und danach zunehmend auf der Oberfläche im indirekten Immunfluoreszenztest nachweisbare Antikörper aus Seren wiederholt infizierter (immuner) Kälber, reagierten aber nicht mit Seren nicht infizierter Tiere. Die Fluoreszenz war homogen auf der Zelloberfläche verteilt. Immunreaktive Oberflächenkomponenten wurden im Fall von infizierten VERO-Zellen nicht nachgewiesen, d. h. die Expression dieser Antigene ist offensichtlich auf die sich entwickelnden und reifen Schizonten begrenzt. Antikörper aus einmalig mit E. bovis-infizierten Kälbern erkennen diese Antigene erst nach Abschluß der Patenz (29 Tage p. i.). Da die Oberflächenantigene auch von Hyperimmunseren gegen E. bovis-Merozoiten I aus Ratten erkannt wurden, ist davon auszugehen, daß es sich um parasiteneigene Antigene handelt.

Immunelektronenmikroskopische, im Präembedding-Verfahren durchgeführte Untersuchungen bestätigten die Bindung der Antikörper auf der Zelloberfläche.

Die Behandlung infizierter (15 Tage p. i.) Zellen mit 1 M NaCl, 1 mM CHAPS und Phospholipase C (1 mg/ml) hatten keinen Einfluß auf die Antikörperbindungsfähigkeit der Zellen. Triton X-100, Triton X-114 und Triton X-405 führten bei geeigneten Konzentrationen und Einwirkungszeiten zur Abschwächung der Antikörperbindung. Proteinase K-Behandlung hatte zur Folge, daß der Anteil reaktiver Zellen drastisch verringert war.
An infizierten (15 Tage p. i.), 3% Formaldehyd-fixierten Zellen affinitätsgereinigte Antikörper aus immunen Kälbern banden wie das komplette unbehandelte Serum an PAGA-fixierte infizierte Zellen, PAGA-fixierte Merozoiten aber im Gegensatz zum unbehandelten Serum nicht an PAGA-fixierte Sporozoiten. In Methanol-fixierten (permeabilisierten) Sporozoiten und Merozoiten reagierten die affinitätsgereinigten Antikörper mit Strukturen im apikalen Bereich der Merozoiten, nicht jedoch der Sporozoiten, während das unbehandelte Serum bei beiden Stadien diffus intrazellulär band. Anhand immunelektronenmikroskopischer Untersuchungen (Postembedding-Verfahren) konnten als intrazelluläre Bindungsstellen der affinitätsgereinigten Antikörper die Mikronemen und Dichten Granula der E. bovis-Merozoiten I identifiziert werden.

Nach SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen erkannten die affinitätsgereinigten Antikörper sowohl in E. bovis-Schizonten enthaltenden BFGC (15 Tage p. i.) als auch in Merozoiten I-Homogenaten mehrere Polypeptide. Die deutlichsten Reaktionen waren in beiden Fällen mit 78 kDa, 72 kDa, 40 kDa und 27 kDa Antigenen zu verzeichnen. Zwei Antigene mit Molekulargewichten von 29 kDa und 45 kDa wurden nur in Homogenaten infizierter Zellen erkannt.

Parasitenantigene auf der Oberfläche Eimeria spp.-infizierter Zellen sind bisher nicht beschrieben worden. Obwohl die Rolle der oben beschriebenen E. bovis-Antigene noch völlig unklar ist, lassen die Ergebnisse dieser Studie vermuten, daß diesen sehr stadienspezifischen Parasitenmolekülen aus Mikronemen und Dichten Granula neue, noch unbekannte Funktionen zukommen.
Kurzfassung auf Englisch: The study deals with the detection and characterization of antigens expressed on the surface of Eimeria bovis infected cells during development of the parasites in vitro.

Four bovine cell lines, 2 of which were primary endothelial cell lines and VERO cells were infected with E. bovis sporozoites in vitro. Development of the parasites to 1st generation schizonts took place only in bovine cells, whereby the best development, regarding the size of the schizonts and merozoite yields, was observed in BFGC, a line of bovine fetal gastrointestinal cells. Although the parasites survived in VERO cells for at least 3 weeks they could not develop to the first schizont stage.
Scanning electron microscopy of the E. bovis infected endothelial cells was used to determine changes of the surface of infected cells during the intracellular development of the parasites. Both nodule- or vesicle-like and villi- or hair-like structures could be detected on the surface of infected cells in the late stage of schizogony.

Sera of repeatedly infected (immune) calves bound to the surface of infected 4% paraformaldehyde/0.25% glutaraldehyde (PAGA)-fixed bovine cells as determined by indirect immunofluorescence test (IIFT) from day 7 after cell invasion onwards. The intensity of the fluorescence increased in parallel with further development of the parasites. Immunoreactive components were not found on infected VERO cells, i. e. expression of these antigens is obviously limited to developing and mature schizonts. There was no reaction with control sera from uninfected animals.
Antibodies from E. bovis single infected calves did not bind to these antigens until the end of patency (29 days p. i.). Since the surface antigens were also recognized by hyperimmune serum from rats immunized with E. bovis first stage merozoites, it is assumed that these antigens are of parasitic origin.

Binding of the antibodies to the surface of infected cells was confirmed by immune electron microscopy (pre-embedding technique).

Treatment of infected (15 days p. i.) cells with 1 M NaCl, 1 mM CHAPS and Phospholipase C (1 mg/ml) did not affect the surface antigenicity of the cells. Triton X-100, Triton X-114 and Triton X-405 reduced the surface fluorescence after IIFT in general while after proteinase K-treatment of infected cells the proportion of reactive cells was drastically reduced.
Immune serum from infected calves was affinity purified on 3% formaldehyde-fixed E. bovis infected cells (15 days p. i.). The affinity purified antibodies reacted in IIFT with the surface of PAGA-fixed infected cells and PAGA-fixed free merozoites similarly to the complete serum, however, in contrast to the untreated serum did not bind to PAGA-fixed sporozoites. In methanol-fixed sporozoites and merozoites the affinity purified antibodies bound to structures within the apical area of merozoites, however, not of the sporozoites, while the untreated serum caused diffuse labelling of the internal structures of both stages. Immune electron microscopy (post-embedding technique) demonstrated the binding of affinity purified antibodies to micronemes as well as to dense granules of E. bovis merozoites.

When tested by immunoblotting under reducing conditions the affinity purified antibodies identified several antigens in both infected cells and merozoite extracts. Prominent bands were seen with both extracts at 78 kDa, 72 kDa, 40 kDa and 27 kDa positions, whereas two antigens with molecular weights of 29 kDa and 45 kDa were recognized only in infected cell homogenates.

Parasite antigens on the surface of cells infected with Eimeria sp. have not been reported so far. Although the roles of the antigens of E. bovis described above are yet completely unknown, the results of this study suggest new functions of these highly stage specific parasite molecules derived from micronemes and dense granules.