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Identifizierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Determinanten der Suszeptibilität und Resistenz im Pathosystem Gerste / Echter Gerstenmehltaupilz

Identification, characterization and functional analysis of determinants of susceptiblity and resistance in the barley - barley powdery mildew pathosystem

Schultheiß, Holger


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Gerste , Mehltaupilz , Resistenz , Suszeptibilität , PR1-b , GTPase, RAC , ROP
Freie Schlagwörter (Englisch): barley , powdery mildew , susceptibility , resistance , PR-1b , GTPase , RAC , ROP
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Phytopathologie und Angewandte Zoologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 05.01.2004
Kurzfassung auf Deutsch: Der Echte Gerstenmehltaupilz, Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh), ist ein obligat
biotropher Ektoparasit der Gerste (Hordeum vulgare L.). Die Penetration der
Epidermiszellwand durch den Pilz ist Voraussetzung zur Einstülpung der Plasmamembran
und der nachfolgenden Etablierung von Haustorien, die der Ernährung des Pathogens dienen.
Zur Verhinderung der Penetration der Zellwand verfügt die Gerste unter anderem über ein
apoplastisch wirkendes Abwehrsystem. Die Expression des apoplastischen pathogenesis related
(PR) Protein 1B in Gerstenblättern nach Bgh Inokulation korrelierte zeitlich und räumlich
mit den Resistenzreaktionen verschiedener anfälliger und resistenter Gerstenlinien. Zur
funktionellen Analyse wurde die Expression von PR-1b durch RNA Interferenz mittels transienter
biolistischer Transformation von PR-1b-dsRNA inhibiert. Da der transiente knockdown
von PR-1b die Penetrationsresistenz der Gerste erniedrigte, handelt es sich bei PR-1B
wahrscheinlich um ein Protein des extrazellulären Pathogenabwehrkomplexes.

Viele Erreger beeinflussen pflanzliche Signaltransduktionskaskaden, um bestimmte physiologische
Eigenschaften der Wirtszelle wie zum Beispiel den Aufbau des Zytoskeletts und den
Redoxzustand ihren Bedürfnissen anzupassen. An diesen Prozessen sind in tierischen wie
auch in pflanzlichen Systemen kleine G-Proteine der RAC/ROP Familie beteiligt. In einem
PCR-basierten Kandidatengenansatz wurden sechs unterschiedliche Gersten-cDNA-Sequenzen
identifiziert, die für RAC/ROP Proteine der Gerste kodieren. Der transiente knock-down
von RACB durch RNA Interferenz erhöhte die Penetrationsresistenz von Wildtyp Gerstenlinien
gegenüber Bgh. In Gerstenlinien, die einen Defekt im Ror1- Gen aufweisen, zeigte der
knock-down von RACB jedoch keinen Effekt. Dies bedeutet, dass die durch RNAi von RacB
vermittelte Resistenz, ebenso wie die mlo-Resistenz von funktionellem ROR1 abhängig ist.
Die Überexpression von konstitutiv aktiviertem RACB, RAC3, ROP4 und ROP6 führte zu einer
erhöhten Anfälligkeit von Gerste gegen Bgh, während die Überexpression von konstitutiv
aktivem RAC1 und RACD keinen Einfluss auf die Gerste - Bgh Interaktion zeigte. Somit
sind einige der kleinen G-Proteine spezifische Suszeptibilitätsfaktoren in der Regulation der
Penetrationsresistenz von Gerste gegen Bgh. Die intrazelluläre Lokalisation von
GFP:RAC/ROP Fusionsproteinen zeigte eine konstitutive Assoziation aller RAC/ROP
Proteine mit der Plasmamembran. Diese ist für die Funktion der RAC/ROP Proteine
essentiell, da die Verhinderung der Plasmamembranassoziation durch Mutagenese der
Lokalisationsdomäne mit einem Verlust der Suszeptibilität-erhöhenden Funktion in der
Gerste - Bgh Interaktion einhergeht.
Kurzfassung auf Englisch: The biotrophic barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) attacks
epidermal cells of barley (Hordeum vulgare L.). The first step of pathogenesis is the
penetration of the cell wall and the invagination of the plasma membrane followed by the
establishment of a haustorium, which is required for nutrition of Bgh. Accordingly the first
line of defence against Bgh is represented by an apoplastic defence system. The expression of
the apoplastic pathogenesis related (PR) protein 1B correlates temporally and spatially with
the onset of defence reactions in near-isogenic barley lines exhibiting various forms of
defence phenotypes including papilla formation and the hypersensitive cell death. To
elucidate PR-1B function, PR-1b expression was transiently silenced by double stranded RNA
(dsRNA) interference using microprojectile mediated transformation of single barley
epidermal cells and observed a decreased penetration resistance of barley to Bgh. This
indicates that PR-1B is part of the apoplastic defence machinery.
The early interaction of barley and powdery mildew is accompanied by the remodelling of the
cytoskeleton and the accumulation of reactive oxygen species (ROI). Small G-Proteins are
known to be involved in the production of superoxide (O2
.-) and the assembly of actin fibres.

Using a candidate RT-PCR approach six cDNAs were identified coding for RAC/ROP
proteins of barley. The transient knock-down of RacB led to a lower penetration efficiency up
to 60 % in susceptible barley lines. Surprisingly the inhibition of RacB expression had no
effect in mutant barley lines lacking the Ror1 gene. That leads to the assumption that the
RacB RNAi effect is dependent on a functional ROR1 that is also required for broad-spectrum
mlo-mediated resistance to Bgh.

The overexpression of constitutively activated (CA) mutant RAC/ROP proteins led to a
RAC/ROP-specific enhancement of accessibility to Bgh. The overexpression of CA RACB,
CA RAC3, CA ROP4 and CA ROP6 enhanced the accessibility of barley to Bgh. Because CA
RACD and CA RAC1 did not influence barley - Bgh interaction, it seems that some of the
RAC/ROP proteins might be specific susceptibility factors, involved in processes supporting
parasitic entry into epidermal host cells. Confocal laser scanning microscopy of
GFP:HvRAC/ROP transformed cells revealed varying strengths of plasma membraneassociation
of barley RAC/ROPs. The C-terminal localisation domain was essential for
membrane association and proper function of the RAC/ROPs in inducing accessibility of
barley to Bgh.