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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1325/


Untersuchung zur immunologischen Bedeutung des Virulenzfaktors SpvD von Salmonella enterica

Prevalence, Molecular Diversity, and Immunological Potential of the Virulence Factor SpvD of Salmonella enterica

Barth, Stefanie


pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.670 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Salmonellen , Plasmid , ELISA , Pferd , Maus
Freie Schlagwörter (Englisch): Salmonella , plasmid , ELISA , horse , mice
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 28.11.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den 'Salmonella plasmid virulence'-Faktor D (SpvD) auf seine Eignung zum Testantigen für die serologische Diagnostik zu untersuchen. Im einzelnen sollte ermittelt werden, mit welcher Häufigkeit das spvD-Gen bei den gegenwärtig in Deutschland bei Tieren verbreiteten Salmonellen vorkommt, wie stark das SpvD in seiner Primärstruktur innerhalb des Genus Salmonella variiert und ob es im Zuge von Salmonelleninfektionen zur Immunreaktion gegen das SpvD-Protein kommt.

Salmonella-enterica-Feldisolate (n = 874), die in den Jahren 1990 - 1999 von Tieren in Deutschland isoliert worden waren und die 18 verschiedenen O-Gruppen angehörten, wurden mittels DNS-DNS-Hybridisierung im Dot-Blot- und Southern-Blot-Verfahren auf das spvD-Gen untersucht. Das spvD-Gen war ausschließlich bei Vertretern von Salmonella enterica Subspezies enterica nachweisbar, wobei 75 % der untersuchten S. Gallinarum/Pullorum-Stämme, 93,5 % der S. Typhimurium-Isolate, jeweils alle S. Enteritidis- und S. Dublin-Isolate sowie beide getesteten Salmonella-Rauhform-Isolate positiv reagierten. Infolge der tierartlich verschiedenen Serovarspektren waren Salmonellen-Isolate von Säugern häufiger Träger des Gens als Isolate von Vögeln oder Reptilien (Rinder 93,9 %, Pferde 92,9 %, Hund/Katze 58,9 %, andere Säu-ger 66,7 %, Vögel 33,3 %, Reptilien 4,6 %).

Um die Strukturvariabilität des SpvD-Proteins zu bestimmen, wurden die spvD-Gene von 17 Salmonella-Feldstämmen sequenziert und in die Aminosäuresequenzen übersetzt. Unter Einbeziehung bereits bekannter spvD-Sequenzen konnten insgesamt neun spvD-Allele differenziert werden, aus denen sich acht SpvD-Varianten mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz ableiten ließen. Mit Ausnahme des spvD-Gens von S. Gallinarum Stamm Ti 184/64 waren die Unterschiede insgesamt gering und serovarabhängig. Beim paarweisen Vergleich betrug die Homologie der Nukleotidsequenzen mindestens 98,8 % (ClustalW-Methode) und die Homologie der Aminosäuresequenzen mindestens 97,7 % (Jotun-Hein-Methode). Dabei waren alle Stämme der Serovare Typhimurium und Dublin in der SpvD-Primärstruktur identisch. Im spvD-Gen von S. Gallinarum Stamm Ti 184/64 war das Codon 73 infolge einer Punktmutation zum Stopcodon mutiert, weshalb dieser Stamm nur für ein N-terminales SpvD-Rudiment kodierte.

Zur Untersuchung der immunogenen Bedeutung von SpvD wurden drei Gruppen von BALB/c-Mäusen zu je neun Tieren oral mit Keimen der Serovare Typhimurium, Enteritidis und Dublin infiziert. Innerhalb der dreiwöchigen Beobachtungsdauer war eine systemische humorale Immunreaktion gegen SpvD und LPS bei zwei (22,2 %) der mit S. Dublin-Keimen infizierten Mäuse nachweisbar. Diese beiden Mäuse sowie sechs weitere Mäuse (29,6 %) aus allen drei Gruppen reagierten auch gegen das jeweilige autologe Bakterienzelllysat serologisch positiv. Die ermittelten Immunglobulin-Titer korrelierten signifikant positiv miteinander und mit der Inokulationsdosis, der Dauer der Erkrankung sowie dem Leber- und Milzgewicht zum Zeitpunkt der Euthanasie (p ≤ 0,039).

Serumproben von 56 Salmonella-infizierten Pferden und 71 kulturell-bakteriologisch Salmonella-negativen Pferden wurden mittels ELISA auf Salmonella-spezifische Antikörper untersucht. Hierbei dienten hochreines rekombinantes SpvD (rSpvD-His) sowie chromatografisch aufgereinigtes LPS von S. Typhimurium (LPSTm) als Testantigene. Die ELISA-Qualität (Summenmaximum aus Sensitivität und Spezifität) wurde anhand von 'receiver operating characteristic'-Kurven auf Grundlage der kulturell-bakteriologischen Befunde bestimmt. Antikörper gegen rSpvD-His und LPSTm konnten in beiden Pferdegruppen nachgewiesen werden. Dabei korrelierten die beiden Tests in ihren Werten signifikant miteinander (p < 0,001). Bei den älteren Pferden (> 6 Monate) besaßen die Salmonellenausscheider unabhängig vom Test-antigen im Mittel signifikant höhere Titer als die Salmonella-negativen Pferde (p < 0,001). In dieser Altersgruppe war der rSpvD-His-ELISA zu 75,9 % spezifisch und zu 70,6 % sensitiv, während der LPSTm-ELISA eine Spezifität von 85,2 % und eine Sensitivität von 70,6 % erzielte. Bei jüngeren Pferden waren die Titer durchwegs niedrig und ein Unterschied zwischen Salmonella-Positiven und Salmonella-Negativen nicht nachweisbar (p > 0,05).

Nach diesen Ergebnissen ist der Virulenzfaktor SpvD ein strukturell hochgradig konserviertes Antigen, das bei den derzeit bei Haustieren zirkulierenden Salmonella-Stämmen mit sehr hoher Prävalenz vorkommt. Aufgrund des besonders hohen Anteils spvD-positiver Salmonellen bei Pferden und Rindern erscheint rekombinantes SpvD als Testantigen bei diesen Tierarten besonders gut geeignet. Als diagnostischer Marker zur Identifizierung von Salmonella-verdächtigen Bakterienisolaten ist das spvD-Gen aber im Vergleich zu anderen genetischen Markern nicht sensitiv genug.
Kurzfassung auf Englisch: The present study aims to determine the applicability of the Salmonella plasmid virulence factor D (SpvD) as antigen in serological detection tests. Particular areas of investigation were the prevalence of spvD in salmonellae circulating currently in animals in Germany, the variations in the primary structure of SpvD, and the presence of a humoral immune response against SpvD during a Salmonella infection.

Salmonella enterica field isolates (n = 874) isolated between 1990 and 1999 from animals in Germany and belonging to 18 different O antigen groups were tested for the presence of spvD by dot blot and southern blot hybridization. The spvD gene was detected in isolates of Salmonella enterica subspecies enterica only. Thereby, 75 % of the tested S. Gallinarum/Pullorum isolates, 93.5 % of the S. Typhimurium isolates, 100 % of the S. Dublin and S. Enteritidis isolates, and both Salmonella enterica rough isolates were spvD positive. Caused by the specific serotype prevalence in the different hosts, salmonellae from mammals possessed the spvD gene more often than salmonellae from birds or reptiles (cattle 93.9 %, horses 92.9 %, dogs/cats 58.9 %, other mammals 66.7 %, birds 33.3 %, reptiles 4.6 %).

The spvD genes of 17 Salmonella field strains were sequenced and translated into their primary structures to assess the antigenetic polymorphism of SpvD. Including already published spvD sequences nine spvD alleles were identified, resulting in eight SpvD variants. With the sole exception of the S. Gallinarum strain Ti 184/64, the SpvD variants possessed only minor differences that were serotype specific. The pairwise alignment showed a nucleotide sequence homology of ≥ 98.8 % (ClustalW method) and an amino acid sequence homology of ≥ 97.7 % (Jotun Hein method). All strains of serotypes Typhimurium and Dublin had identical SpvD primary structures. Due to a single nucleotide substitution in the spvD gene of S. Gallinarum strain Ti 184/64 at codon 73, a translation stop codon was introduced, so that the gene encoded the 72 amino-terminal amino acids of SpvD only.

Three groups of 9 BALB/c mice were orally inoculated with bacteria of S. Typhimurium, S. Enteritidis or S. Dublin, respectively. Within 3 weeks a systemic humoral immune response against SpvD and LPS was detectable in 2 (22.2 %) of the S. Dublin inoculated mice. These 2 as well as additional 6 mice (29.6 %) of all three groups reacted serologically positive against autologous bacterial cell lysate. A significant positive correlation was found between results of the ELISAs, as well as between the titers and the inoculation dose, the duration of illness, and the weight of liver and spleen (p < 0.039).

Serum samples from 56 Salmonella positive horses and 71 bacterial culture negative horses were tested by ELISA for Salmonella specific antibodies. Highly pure recombinant SpvD (rSpvD-His) and chromatographically purified LPS from S. Typhimurium (LPSTm) served as test antigens. The ELISA quality (maximum score of summarized sensitivity and specificity) was determined with regard to the cultural isolation of Salmonella by receiver-operating-characteristic curves. In both groups of horses antibodies against rSpvD-His and LPSTm were detectable. The values of the two ELISAs correlated strongly positive (p < 0.001). Of those horses older than six month, the Salmonella positive horses revealed a higher mean titer than the Salmonella negative horses (p < 0.001). In this age group of horses the rSpvD-His-ELISA was 75.9 % specific and 70.6 % sensitive, while the LPSTm-ELISA revealed 85.2 % specificity and 70.6 % sensitivity. The titers in younger horses were lower throughout and no difference was detectable between Salmonella positive and negative animals (p > 0.05).

The virulence factor SpvD is a highly conserved antigen with a high prevalence in current circulating Salmonella strains from animals in Germany. The particularly high percentage of spvD positive strains in horses and cattle suggests that recombinant SpvD is suitable as a test antigen for these animals. As a diagnostic tool for the precise identification of putative Salmonella isolates, however, the spvD gene lacks the required sensitivity in comparison to other genetic markers.