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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-13075
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1307/


Mechanismus Hypoxie-induzierter Permeabilitätsveränderungen am in vitro Modell der Bluthirnschranke

Wobben, Maria Anne


pdf-Format: Dokument 1.pdf (11.561 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Hypoxie , Permeabilitätsveränderungen , Bluthirnschranke , zonula occludens
Freie Schlagwörter (Englisch): Hypoxia , Permeability changes , blood-brain barrier , tight junctions
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max Planck Institut für Physiologische und Klinische Forschung, Kerckhoff-Institut, Abt. für Experimentelle Kardiologie
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 13.11.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Mechanismus Hypoxie-induzierter Permeabilitätsveränderungen am in vitro Modell der Bluthirnschranke


Nach Bestätigung der unbeeinträchtigten Viabilität der Zellen post 24 stündiger Hypoxie, konnte ein signifikanter Permeabilitätsanstieg unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu Kontrollkulturen über den parazellulären Weg nachgewiesen werden. Dieser Transportweg wurde daraufhin hinsichtlich der Expression des Tight Junction Proteins ZO-1 in microvasculären Hirnendothelzellen vom Schwein (BMEC), RBE4- und CSG-Zellen näher untersucht. Dabei wurde eine veränderte Expressionslokalisation dieses Proteins nach 24 stündiger Hypoxie sichtbar. Nachweislich war diese Veränderung bei allen verwandten Endothel- und Epithelzellen sichtbar. In weiterführenden Untersuchungen, die eine Beteiligung zytoskeletaler Elemente an diesen Veränderungen fokussierten sollten, konnten im Hinblick auf die F-Aktin Expression bei allen verwendeten Zelllinien nur leichte Veränderungen im Sinne einer Streßfiberbildung nachgewiesen werden, wobei der quantitativ bestimmte F-Aktin Gehalt unverändert war. Da hypoxiebedingte Permeabilitätsveränderungen häufig durch unter hypoxischen Bedingungen gebildetes VEGF hervorgerufen werden, sollte dessen Einfluß hinsichtlich einer veränderten ZO-1 Expression unter hypoxischen Bedingungen untersucht werden. Nach Zugabe eines polyklonalen Antikörpers gegen VEGF konnten die beschriebenen Veränderungen vollständig verhindert werden, was für BMEC-, RBE4- und CSG-Zellen gezeigt werden konnte. Somit scheint das unter Einfluß von Hypoxie gebildete VEGF die Permeabilität des Zellmonolayers über den parazellulären Weg zu erhöhen. In weiterführenden Untersuchungen konnte ein Zusammenhang zwischen der Wirkung des VEGF und hypoxischen Bedingungen bestätigt werden, da die Zugabe von VEGF zu normoxischen Kulturen keine Veränderungen hervorrief, wohingegen unter Zusatz von VEGF und Antioxidantien zu normoxischen Kulturen ebenfalls eine veränderte Expression des ZO-1 auftrat. Westernblotanalysen zeigten keine Veränderungen der Proteinexpression des ZO-1 zwischen den unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen inkubierten BMEC- und CSG-Zellen. Allerdings konnte nach Ablauf von 24 stündiger Hypoxie eine erhöhte Phosphorylierung des ZO-1 sowohl bei BMEC als auch bei CSG nachgewiesen werden, die durch einen Antikörper gegen VEGF verhindert werden konnte, wie in BMEC-Kulturen gezeigt wurde. Es zeigt sich, daß VEGF an der Phosphorylierung des ZO-1 unter hypoxischen Bedingungen beteiligt ist. In Kokulturversuchen mit Astrozyten und C6-Zellen zeigte sich bereits unter normoxischen Bedingungen eine geringere Permeabilität als bei den Kontrollkulturen ohne Kokultur. Unter hypoxischen Bedingungen wurde der Permeabilitätsanstieg sowohl von Astrozyten als auch von Gliomazelleneindrucksvoll verhindert. In sich anschließenden immunhistochemischen Versuchen wurde den BMEC-Zellen konditioniertes Medium von C6-Gliomazellen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen für die Dauer von 24 Stunden zugesetzt. Tatsächlich konnten die vorher unter Hypoxie nachweisbaren Veränderungen im Sinne einer veränderten ZO-1 Expression nun nicht mehr nachgewiesen werden.
Kurzfassung auf Englisch: Vascular endothelial growth factor induced hyperpermeability in brain microvessel endothelial cells involves phosphorylation of zonula-occludens-1


Pathological conditions like hypoxia have been associated with disruption of the blood-brain barrier (BBB) leading to the development of vasogenic brain edema. We set out to ascertain the mechanism by which hypoxia regulates paracellular permeability of the BBB using an in vitro model of the BBB, consisting of primary cultures of porcine brain derived microvascular endothelial cells (BMEC). Paracellular passage across endothelial cell monolayers is known to be regulated by specialized intercellular structures like the tight junctions (TJ). Immunohistochemistry revealed that 24 hours of hypoxia disrupted the continuity of the tight junction protein, zonula occludens-1 (Z0-1), which lines the cytoplasmic face of intact tight junctions. Recently, it was demonstrated that hypoxia-induced permeability in vitro is mediated by vascular endothelial growth factor (VEGF) in an autocrine manner via the release of NO. Accordingly to these results, hypoxia-induced changes of the ZO-1 distribution were reversed in the presence of a polyclonal neutralizing antibody to VEGF. Furthermore, the addition of VEGF in the presence of antioxidants, which stabilize the second messenger NO, changed the ZO-1 distribution in the same manner as hypoxia. Similar changes of the ZO-1 distribution after hypoxia and VEGF treatment were observed when the endothelial cell line, RBE4, or the epithelial cell line, CSG, were used. Western blot analysis revealed that hypoxia caused tyrosine phosphorylation of ZO-1, which was reversed in the presence of a polyclonal neutralizing antibody to VEGF. Results suggest that phosphorylation of ZO-1 likely contributes to VEGF-induced endothelial paracellular permeability.