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Gerichtete Mutagenese am Natrium-abhängigen Gallensäuretransporter Ntcp zur Bedeutung negativ geladener Aminosäuren als Natrium-Sensor

Zahner, Daniel


Originalveröffentlichung: (2003) Wettenberg : VVB Laufersweiler 2003
pdf-Format: Dokument 1.pdf (3.937 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Gallensäure , Ntcp , Mutation
Freie Schlagwörter (Englisch): Bile Acid , Ntcp , mutation
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Zeitschrift, Serie: Edition scientifique
ISBN / ISSN: 3-89687-646-5
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.07.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 05.11.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Gallensäuren zirkulieren bei Säugern im enterohepatischen Kreislauf zwischen dem Darm,
der Leber und der Galle. An der Leber der Ratte werden Gallensäuren durch das
Na+/Taurocholat cotransportierende Polypeptid (Ntcp) aus dem Portalblut in die
Leberparenchymzellen transportiert. Ziel dieser Untersuchungen war es, über
Mutagenesestudien am Ntcp funktionell notwendige, negativ geladene Aminosäuren in dem
Protein zu identifizieren und zu klären, ob diese an der Na+-Bindung des Proteins beteiligt
sind.

Durch Site-directed Mutagenese wurden, ausgehend von dem cDNA-Klon des Ntcp,
Mutantenklone generiert, bei denen je eine von sieben negativ geladenen Aminosäuren,
nämlich D24, E47, E89, D115, D147, E257 und E277 (fünf konservierte und zwei nicht
konservierte), durch ihre neutralen Amide ersetzt wurden. Bei heterologer Expression in X.
laevis-Oozyten wurde die Funktionalität der Klone durch Messung der
[3H]Taurocholataufnahme in die Zellen geprüft. Die drei Mutationen D24N, D115N und
E257Q reduzierten die [3H]Taurocholataufnahme hochsignifikant. Diese Klone wurden nach
Markierung mit dem FLAG®-Tag durch Immunfluoreszenzmikroskopie auf ihre Präsenz in
der Oozytenmembran untersucht. Von den drei waren die Mutanten D115N und E257Q in der
Oozyten-Oberfläche nachweisbar, während D24N dort fehlte. Dies zeigt, dass D24 zur
korrekten Membraninsertion des Proteins notwendig ist. Durch Variation der Na+-
Konzentration im Medium wurde die Na+-Abhängigkeit der [3H]Taurocholataufnahme der
Klone D24N, D115N und E257Q und des Wildtyp-Ntcp bestimmt. Beim Wildtyp-Ntcp und
den Mutanten D24N und D115N ergab diese eine Sättigungskinetik. Bei Mutante E257Q
bestand eine lineare Beziehung zwischen [3H]Taurocholataufnahme und der externen Na+-
Konzentration. Der Hill-Koeffizient der [3H]Taurocholataufnahme des Wildtyp-Ntcp beträgt
2, er verringerte sich auf 1 für die Mutante D115N und 0,4 für die Mutante E257Q. Hieraus
läßt sich schließen, dass E257 an der Natriumbindung beteiligt ist.

Diese Ergebnisse führten zu einer Hypothese über die Struktur-Funktions-Beziehung in dem
Ntcp-Molekül, nach der sich in der Region des E257 eine Struktur ausbildet, die vergleichbar
einem P-loop in Kaliumkanälen, in die Pore des Transporters hineinragt und bei der E257 eine
Natriumbindungsstelle darstellt.
Kurzfassung auf Englisch: In mammalians bile acids circulate between the gut, the liver and the bile in the enterohepatic
circulation. The absorption of bile acids from the gut lumen as well as their clearance from
portal blood is mediated by Na+/bile acid cotransporters. In the liver the Na+/bile acid
cotransporter is the Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (Ntcp). The aim of this study
is to identify negatively charged amino acids with functional importance for Na+-taurocholate
cotransport and to investigate, whether these amino acids are involved in Na+-binding by the
protein.

Ntcp mutants were generated by site-directed mutagenesis of the cDNA-clone of the Ntcp.
Seven negatively charged amino acids, namely D24, E47, E89, D115, D147, E257 und E277
(five conserved and two non conserved), were mutated into their uncharged amides.
Functionality was proven by heterologeous expression in X. laevis-oocytes and
[3H]taurocholate uptake in the cells. The three mutations D24, D115 and E257 reduced
[3H]taurocholate uptake significantly. These clones were tagged by the FLAG®-motiv in order
to follow their expression by immunofluorescence microscopy. The mutants D115N and
E257Q were detected in the cell-membrane of the oocytes whereas mutant D24N was not
present their. This indicates a role of D24 in the appropriate membrane sorting of the Ntcpprotein.
The Na+-dependence of the [3H]taurocholate uptake was determined by altering the
Na+-concentrations. Wildtype-Ntcp and the mutants D24N and D115N showed saturation
kinetics whereas mutant E257Q exhibited a linear relation between [3H]taurocholate uptake
and Na+-concentration. The Hill-coefficient of the [3H]taurocholate uptake of wildtype-Ntcp
is 2 and it changed to 1 for the mutant D115N and 0,4 for the mutant E257Q. These results
lead to the conclusion, that E257 is involved in Na+-binding.

This study shows, that the amino acids D24, D115, and E257 are of functional relevance for
the Ntcp. D24 is required for the folding across or the insertion into the membrane. D115
might generate the cytoplasmatic Na+-binding site of a P-loop structure from which sodium
ions are released into the cytoplasma. E257 is with high probability involved in the binding of
extracellular sodium ions.