Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-12459
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1245/


Diagnose der bakteriellen Sepsis des bovinen Neonaten durch Amplifizierung bakterieller 16S-ribosomaler DNA mittels Polymerasekettenreaktion

Use of polymerase chain reaktion to detect septicemia in bovine neonates by amplification of bacterial 16S-ribosomal DNA

Noll, Irene


pdf-Format: Dokument 1.pdf (764 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Freie Schlagwörter (Deutsch): Sepsis , Blutkultur , 16S rRNA , Kalb , Polymerasekettenreaktion
Freie Schlagwörter (Englisch): Septicemia , Blood Culture , 16S rRNA , Calf , Polymerase Chain Reaction
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz und dem Zentrum für Kinderheilkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen - Interdisziplinäre Arbeitsgruppe Perinatologie/Neonatologie -
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.08.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 23.09.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Zur Sicherung einer klinischen Sepsisdiagnose beim bovinen Neonaten ist ein
positiver Erregernachweis erforderlich. Bisher wird die Blutkultur als gold
standardg betrachtet. Der zeitliche Abstand zwischen Probenentnahme und
Vorliegen eines verwertbaren Ergebnisses ist jedoch so gros, dass eine sichere
und zielgerichtete Versorgung eines erkrankten Kalbes erst nach einer erheblichen
zeitlichen Verzogerung durchgefuhrt werden kann.

Die PCR hingegen ermoglicht den Nachweis bakterieller DNA im Blut innerhalb
von 7-14 Stunden. In der vorliegenden Arbeit fanden dazu 16S-rRNAUniversalprimer
Anwendung. Durch die Nutzung eines Polymerasekettenreaktion-
Nachweises zur Detektion bakterieller DNA im Blutplasma und Leukozyten
schwerwiegend erkrankter Kalber sollte ein Testverfahren etabliert werden,
welches den Anspruchen eines modernen, schnellen und zuverlassigen
Untersuchungsverfahrens Rechnung tragt.

Insgesamt standen 126 Blutproben von 53 schwerwiegend erkrankten und 20
gesunden Kontrolltieren im Alter von 1 bis 23 Tagen verschiedener Rassen und
Rassekreuzungen fur diese Arbeit zur Verfugung. Die Einteilung erfolgte in die
Gruppen 'septisch erkrankte Tiere', 'schwer einzelorganerkrankte Tiere' und
'Kontrolltiere'. Die Gruppenzuteilung erfolgte anhand der klinischen
Untersuchungsergebnisse. Die entnommenen Blutproben wurden parallel mittels
Blutkultur und PCR analysiert.

Die blutkulturelle Untersuchung zeigte, dass E.coli bei 24,2% der 33 positiven
Proben als ursachlicher Krankheitserreger in Reinkultur nachgewiesen werden
konnte. Mit funf positiven Einzelnachweisen und somit einem Anteil von 15,2%
folgten die Pseudomonas Species. Staphylococcus epidermidis, Klebsiella
pneumoniae sowie Enterococcus, Corynebacterium und Neisseria Species stellten
jeweils einen Anteil von 6%.

Die mischkulturellen Nachweise in der Blutkultur erstreckten sich vor allem auf
Vertreter der Gattung Staphylococcus, ƒ¿-hamolysierende Streptokokken,
Enterococcus und Acinetobacter Species.

Im Zuge der molekularbiologischen Untersuchung der Kalberblutproben gelangten
in 57 Fallen in den Leukozyten und 29 mal im Blutplasma positive Nachweise. 65
Blutproben enthielten weder im Plasma noch in den Leukozyten Spuren
bakterieller DNA. Lediglich 5,8% der Proben wiesen Bakterienanteile im
Blutplasma, nicht aber in den Leukozyten auf.

Von den insgesamt 126 untersuchten Proben zeigten 60 sowohl in der Blutkultur
als auch in der PCR keinen Bakteriennachweis. Das positive Ergebnis von
Blutkultur und PCR stimmt bei 28 Blutproben (69,8%) uberein. Das positive
Blutkulturergebnis von 5 Proben wurde nicht durch die PCR-Untersuchung
bestatigt, woraus sich ein prozentualer Anteil von 4,0% ergibt. Jedoch konnte in 33
(26,2%) weiteren Proben bakterielle DNA mittels PCR entdeckt werden, welche
nicht im Stande waren, Bakterienwachstum in der Blutkultur auszulosen. Der
Anteil falsch positiver Proben betragt fur die Blutkultur 3%, fur den PCR-Nachweis
4,9%.

Die statistische Auswertung bestatigte, dass sowohl der Zusammenhang als auch
der Unterschied zwischen dem Ergebnis des Bakteriennachweises mittels
Polymerasekettenreaktion und Blutkultur signifikant sind (jeweils p<0,001).

Zur genaueren Beurteilung von wahr und falsch positiven Proben wurde
retrospektiv das Schicksal der einzelnen Kalber bewertet. Nur ein blutkultureller
Nachweis von Staphylococcus intermedius und drei PCR-Ergebnisse bei klinisch
gesunden Kontrolltieren konnten eindeutig als falsch positiv bewertet werden.

Ein statistisch signifikanter Einfluss einer antibiotischen Behandlung auf die
Untersuchungsergebnisse der Blutkultur und PCR lies sich nicht nachweisen.

Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit zeigen des Weiteren, dass bei 73,7%
der klinisch als septisch eingestuften Kalber bereits nach einer Blutuntersuchung
mittels PCR Bakterienbestandteile entdeckt werden konnten, wahrend dies bei der
Blutkultur nur 47,4% waren. Nach Berucksichtigung von zwei Blutuntersuchungen
zeigten 100% der septisch eingestuften Kalber positive PCR-Ergebnisse, mittels
Blutkultur jedoch nur 61,5%. In der Gruppe der schwer einzelorganerkrankten
Kalber war ebenfalls zu beobachten, dass ein groserer Anteil von Tieren bereits
nach einer PCR-Untersuchung positive Resultate vorwies (58,8%) als nach zwei
Untersuchungen mittels Blutkultur (54,5%). Das bedeutet eine statistisch
signifikante Steigerung des pradiktiven Wertes bereits nach einer
Blutuntersuchung (p<0,001).

Durch den Einsatz der PCR zur Feststellung einer Bakteriamie bei septisch
erkrankten Kalbern liegt ein reprasentatives Ergebnis in erheblich kurzerer Zeit
vor.
Kurzfassung auf Englisch: The affirmation of a clinical sepsis diagnosis in neonatal calves requires a positive
evidence of pathogens. So far the blood culture has been considered as 'gold
standard'. Due to the considerable time gap between the set up and the results
blood culture is rarely been exercised whereas the PCR allows proof of bacterial
DNA in the blood within a few hours. For this study broad-range primers targeting
an conserved region of bacterial DNA that codes for the 16S-ribosomal DNA have
been used to detect bacteria in both plasma and leukocytes.

A total of 126 blood samples collected from 53 critically ill as well as 20 healthy
control calves at the age of 1 to 23 days of different breeds and cross-breeds had
been at disposal for this study. The calves were classified, according to the clinical
results, in three groups: clinically septic, seriously single organ deceased and
control calves. The blood samples taken of the animals had been simultaneously
examined by blood culture and PCR. The bacteriological culture of blood gave
evidence that E.coli had been the etiological pathogen in 24.2% of 33 positive
samples. Second with 5 positive results (15.2%) had been Pseudomonas species.
Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae as well as Enterococcus,
Corynebacterium and Neisseria species had a quota of 6% each. Polymicrobial
growth was observed in six cases. Bacterial combinations isolated in this study
were mainly Staphylococci, á-hemolytic Streptococci, Enterococcus and
Acinetobacter species.

In the course of the molecular biological examination of the calf blood samples
positive evidence was to be achieved in leukocytes in 57 cases and in blood
plasma in 29 cases. 65 of the samples contained neither in plasma nor in
leukocytes any traces of bacterial DNA. Only 5.8% of the samples presented
bacterial DNA in the blood plasma but not in the leukocytes. 60 of the total of 126
samples examined showed no evidence of bacteria, neither in blood culture nor in
PCR. The positive results of blood culture and PCR matched in 28 cases of the
blood tests (69.8%). In 5 cases (4.0%) the positive result of blood culture had not
been corroborated by PCR examination. Yet in more 33 cases (26.2%) it was
possible to detect bacterial DNA by means of PCR, which was not capable of
causing an increase of bacteria in the blood culture. The percentage of false
positive results using blood culture can be stated 3%, for PCR 4.9%.

The statistical evaluation confirms the assumption that the connection as well as
the differences between the results of the bacterial evidence by means of PCR
and in comparison by means of blood culture have to be described as significant
(p<0.001).

For a more exact evaluation of true and false positive tests the fate of the calves
has been evaluated in retrospect. Only one blood evidence of Staphylococcus
intermedius and three PCR results of clinical healthy control animals could be
explicitly proven to be false positive. A statistically significant influence of a
treatment with antibiotics on the results of blood culture and PCR was not be
detected.

Further the results of this study demonstrate that in 73.7% of cases which were
classified as septic in clinical terms it was possible to provide evidence of bacterial
components by using PCR whereas the hit rate using blood culture measured only
47.4%. In consideration of two blood examinations 100% of the calves classified
as septic showed positive PCR-results but only 61.5% were detected by using
blood culture. In the group of seriously single organ diseased calves it was also to
be observed that the positive results received by only one PCR examination
(58.8%) outnumbered the positive results gained by two blood cultural
examinations (54.5%) slightly. It is concluded that the use of PCR to detect
bacteriemia in suspected septic neonatal calves was significantly more sensitive
than conventional blood culture techniques (p<0.001).

Using PCR for the diagnosis of a bacteremia in calves with suspected sepsis leads
to representative results in considerable less time compared to blood culture.