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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1138/


Immunhistologische und morphometrische Untersuchungen zur proliferativen Aktivität adrenokortikaler Zellen der Wistar-Ratte

Immunhistologic and morphometric investigations concerning the proliferative activity of adrenocortical cells of the Wistar rat

Knippel, Anja


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Nebenniere , Wistar-Ratte , Zellproliferation , BrdU , Apoptose
Freie Schlagwörter (Englisch): adrenal , Wistar rat , cell proliferation , BrdU , apoptosis
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Pathologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.04.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 27.06.2003
Kurzfassung auf Deutsch: In der Literaturübersicht werden Zusammenhänge zwischen Zellproliferation und Kanzerogenese, die verschiedenen Methoden zur Proliferationsmessung sowie Methoden und Schwierigkeiten der Apoptosemessung dargestellt. Zusätzlich wird die Nebennierenrinde der Ratte im Hinblick auf ihre Physiologie, Zellproliferation, Apoptose und Steroidsynthese, sowie der Einfluß verschiedener inhibitorischer und stimulierender Substanzen auf diese Parameter dargestellt.

In einem Vorversuch wurde eine Meßstrategie für BrdU-markierte Nebennierenrindenzellen etabliert. Für jede der drei morphologisch und funktionell unabhängigen Rindenzonen wurde getrennt der prozentuale Anteil BrdU-positiver Zellen, der sogenannte 'Labeling Index' (LI), ermittelt. Die gewählte Tierzahl, die Dauer der Markerapplikation, die Schnittebenen, unabhängige Zählungen, Wiederholungszählungen und die Anzahl jeweils ausgewerteter Zellkerne beeinflussen das Meßresultat. Mit Hilfe der statistischen Varianzkomponentenanalyse wurde ermittelt, wie ein möglichst genauer Meßwert bei vertretbarem Arbeitsaufwand erzielt werden kann.

Eine kontinuierliche BrdU-Applikation über 7 Tage mittels einer subkutan implantierten Minipumpe erwies sich als optimal für die Untersuchung der Nebennierenrindenproliferation der Ratte. Eine Gruppengröße von 10 Tieren pro Behandlungsgruppe liefert eine Sensitivität, mit der Unterschiede zwischen Gruppen von ca. 10% mit 90%iger Wahrscheinlichkeit erkannt werden können. Die einmalige Auszählung in einer Präparatebene liefert einen ausreichend genauen Meßwert, wenn für jede der drei Zonen mindestens 1000 Zellkerne ausgewertet werden.

Es wurden die Wirkungen des physiologischen Nebennierenrindenstimulans ACTH, des synthetischen Glukokortikoids Dexamethason als inhibierende Substanz, sowie eines Aminomethyl-Chroman-Derivats auf die Proliferation und Apoptose der Nebennierenrinde, das absolute und relative Nebennierengewicht sowie die ACTH- und Kortikosteronblutplasmaspiegel überprüft. Zwei Untersuchungszeitpunkte, nach einer und nach vier Wochen Behandlungsdauer, sollten Aufschluß über den zeitlichen Verlauf einer möglichen Wirkung liefern. Die Messung der Apoptoserate erfolgte mittels der TUNEL-Methodik.

Die Kontrollgruppe wies die höchsten LIs in der Zona fasciculata auf. Die Zona glomerulosa und die Zona reticularis waren vergleichbar und zeigten eine niedrigere proliferative Aktivität. Dies spricht gegen die sogenannte Migrationstheorie, laut welcher nur Zellen im Bereich der Zona glomerulosa neue Zellen bilden, welche dann kontinuierlich Richtung Mark weitergeschoben werden.

In der Kontrollgruppe wurden die rechte und linke Nebenniere ausgewertet und sie wiesen eine unterschiedliche proliferative Aktivität auf. Daher sollten in Proliferationsstudien immer seitengleiche Nebennieren der Gruppen miteinander verglichen werden.

ACTH rief zu beiden Untersuchungszeitpunkten eine deutliche Nebennieren-gewichtserhöhung sowie eine gesteigerte Zellproliferation in den beiden äußeren Zonen hervor. Die Zona glomerulosa wurde zu Zellen vom Zona fasciculata Typ transformiert, ein Phänomen, daß auch in der Literatur beschrieben wird. Die Anzahl der apoptotischen Zellen nahm 24 Stunden nach der letzten ACTH-Applikation zu. Dies wurde als Gegenregulation auf die primäre trophische ACTH-Wirkung gewertet. Diese Interpretation wird durch die 24 Stunden nach der letzten Substanzapplikation gewonnenen Kortikosteron- und ACTH-Blutplasmaspiegel bestärkt, da hier ebenfalls
'Rebound-Phänomene' sichtbar werden.

Dexamethason führte zu keinen Nebennierengewichtsveränderungen, zeigt aber zu beiden Untersuchungzeitpunkten eine erniedrigte Zellproliferation in der Zona fasciculata. Hier erweist sich die Proliferationsmessung als die sensitivere Methode und es wird deutlich, daß eine zonal getrennte Messung für die Detektion eines subtilen Effektes unbedingt erforderlich ist, insbesondere, wenn Organkompartimente unterschiedliche Funktionen wahrnehmen.

Das Aminomethyl-Chroman wurde in einer niedrigen und hohen Dosis geprüft. Die niedrige Dosis zeigt keinerlei Effekte, während in der hohen Dosisgruppe nach einwöchiger Behandlung eine deutliche Nebennierengewichtserhöhung und Proliferationssteigerung sichtbar wurde. Bereits nach 4 Wochen war eine Homöostase eingetreten, da nun keine Unterschiede zu der Kontrollgruppe mehr auszumachen waren. Die Ergebnisse der Proliferationsmessungen lassen keine erhöhte Inzidenz von Nebennierenrindentumoren in einer Kanzerogenitätsstudie erwarten.
Kurzfassung auf Englisch: The first part of the bibliographical review describes relations between cell
proliferation and carcinogenesis, different methods for measuring cell proliferation as
well as the methods and difficulties of measuring apoptosis. The second part deals
with the rat adrenal cortex and its physiology, cell proliferation, apoptosis and steroid
synthesis, as well as the effect of various inhibitory and stimulatory substances on
these parameters.

In a preliminary study a measurement strategy for BrdU-labeled adrenocortical cells
was established. For each of the three morphologically and functionally independent
cortical zones the percentage of BrdU positive cells, the so called Labeling Index (LI),
was determined. The animal number chosen, the duration of label administration,
different cutting planes, independent countings, repeated countings, and the number of
evaluated cell nuclei influence the result of the measurements. Using the statistical
variance component analysis, it was determined how a high degree of measurement
accuracy can be achieved with a feasible workload.

A continuous BrdU-administration for 7 days using a subcutaneously implanted
osmotic minipump proved to be the best method for investigating rat adrenal cortex
proliferation. A group size of 10 animals per treatment group provides a sensitivity
which detects deviations between groups of approximately 10% with a likelihood of
90%. A single counting in one cutting plane yields a sufficiently precise measurement
value, if at least 1000 cell nuclei are counted in each of the three zones.

The effects of the physiologic adrenocortical stimulant ACTH, the synthetic
glucocorticoid dexamethasone as an inhibiting substance, and an aminomethyl
chroman were examined with regard to proliferation and apoptosis of adrenal cortex,
absolute and relative adrenal weights, and ACTH- and corticosterone-blood plasma
levels. Two investigation timepoints, after one and four weeks of drug exposure, were
expected to yield information on the time course of a possible effect. Measurement of
apoptotic cells was performed using the TUNEL-method.

The control group showed the highest LIs in the zona fasciculata. The zona
glomerulosa and zona reticularis were comparable and showed a lower proliferative
activity. This contradicts the so called migration theory, according to which cells
originate in the Zona glomerulosa and newly formed cells migrate towards the
medulla.

For the control group, the right and left adrenal glands were evaluated, and they
showed a different proliferative acitivity. Therefore, in proliferation studies, always
adrenal glands of the same side should be compared between treatment groups.

At both investigation timepoints, ACTH caused a pronounced increase of adrenal
weights and of cell proliferation in the outer two zones. The zona glomerulosa was
transformed to cells of the zona fasciculata type, a phenomenon which is also
described in the literature. The number of apoptotic cells showed an increase 24 hours
after the last ACTH administration. This was interpreted as to reflect a counterregulation
to the primary trophic ACTH effect. This interpretation is confirmed by the
corticosterone- and ACTH- blood plasma levels determined 24 hours after the last
substance administration, which also showed rebound phenomena.

Dexamethasone did not induce adrenal weight alterations, but a lower cell
proliferation was observed in the zona fasciculata at both investigation time points. It
turns out that proliferation measurement is more sensitive and that a separate
measurement by zones is absolutely necessary for the detection of a subtle effect,
especially when different organ compartments are responsible for different functions.

The aminomethyl chroman was tested as a low and a high dose. The low dose showed
no effects, whereas the high dose exhibited increased adrenal weights and enhanced
proliferation after one week of treatment. After four weeks a homeostasis was already
achieved, as differences to the control group were no longer visible.
Concerning the results of the proliferation measurement, an increased incidence of
adrenal cortex tumors is not expected to occur in a carcinogenicity study.