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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-11322
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1132/


Bedeutung der Glykosylierung für die Pathogenese der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien

Role of Glycosylation for the Pathogenesis of Transmissible Spongiforme Encephalopathies

Neuendorf, Erdmute


Originalveröffentlichung: (2003) Berlin : <a href=http://www.menschundbuch.de/>Mensch und Buch Verlag</a> 2003 </TD>
pdf-Format: Dokument 1.pdf (21.246 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): TSE , Scrapie , transgen , konversion , Prion
Freie Schlagwörter (Englisch): TSE , Scrapie , transgenic , conversion , prion
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Standort Tübingen
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
ISBN / ISSN: 3-89820-503-7
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.08.2002
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 26.06.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung der Glykosylierung des Prionproteins für die Pathogenese der Scrapie-Erkrankung zu untersuchen.
Obwohl nach dem derzeitigen Wissensstand ein fehlgefaltetes Protein (PrPSc) die Krankheit verursacht, können bei der Scrapie-Erkrankung verschiedene Stämme unterschieden werden. Zuckerseitenketten des Prionproteins werden als eine mögliche Ursache dieser Stammvielfalt diskutiert.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten deshalb verschiedene transgene Mäuse hergestellt werden, die un- bzw. monoglykosyliertes Mausprionprotein exprimieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Deletion der ersten Erkennungssequenz für N-Glykosylierung durch den Austausch von Threonin zu Alanin an Kodon 182 des Maus-Prionproteins zu einer gestörten PrPsen-Synthese mit behinderter Oberflächenexpression führt. Ebenso waren transgene Mäuse mit dieser Mutation resistent gegenüber einer Scrapie-Infektion mit zwei verschiedenen Stämmen. Die Zerstörung der zweiten Glykosylierungsstelle beeinträchtigte indes weder Trafficking noch die grundsätzliche Scrapie-Infizierbarkeit. Da es in der Literatur Hinweise gab, dass PrPsen auf der Zelloberfläche exprimiert werden muss, damit PrPres Zellen infizieren kann, stellte sich die Aufgabe transgene Tiere herzustellen, deren glykosylierungsmutiertes PrP möglichst authentisch prozessiert wird, um so eine wichtige Grundvoraussetzung für die Infizierbarkeit der Mäuse zu schaffen. Aus diesem Grund wurden verschiedene Erkennungssequenz-mutierte PrP-Moleküle in Zellkultur charakterisiert. Dazu wurden über 20 verschiedene PrPsen-Mutanten kloniert, sequenziert und anschließend in verschiedenen Zelllinien mit immunologischen und biochemischen Methoden untersucht. Mittels Oberflächenbiotinylierung, Immunfluoreszenz, Endo H-Verdau und Durchflusszytometrie wurde die Zell-Topologie der PrP-Mutanten ermittelt. Im Westernblotverfahren in Verbindung mit PNGase F-Verdau wurde der Glykosylierungszustand der Moleküle untersucht. Die Verankerungsform der Moleküle wurde mittels PIPLC-Verdau, das Vorhandensein von Schwefelbrücken in einem weiteren proteinbiochemischen Verfahren untersucht. Über Ultrazentrifugation wurde die Löslichkeit der Moleküle bestimmt.
Nach der Charakterisierung von PrPsen wurden verschiedene ausgewählte Mutanten in scrapieinfizierten Zellen (ScN2a) auf Umfaltbarkeit in ihre Proteinase K-resistente Isoform PrPres untersucht. Zu diesem Zweck wurden ScN2a Zellen mittels eines retroviralen Systems transduziert und Zellhomogenate direkt bzw. nach Proteinase K-Verdau und Ultrazentrifugation im Westernblot untersucht. Dabei zeigte sich, dass prinzipiell jede der sechs untersuchten Mutanten (Wt3F4, T182A, T182N, T198A, T182A/T198A, T182N/T198A) konvertierbar war. Die unglykosylierte Mutante T182N/T198A zeigte jedoch einen dominant-negativen Effekt, d.h. eine Umfaltung war nur möglich, wenn dieses Konstrukt in geringen Mengen in der Zelle exprimiert wurde. In Anwesenheit von vielen mutierten PrPsen-Molekülen konnte keine Konversion dieser Mutante detektiert werden, während gleichzeitig die nachweisbare Menge an endogenem Maus- PrPres abnahm. Dieser Effekt wurde bis dato noch nicht im Zusammenhang mit Mutationen in diesem Bereich des Prionproteins beschrieben.
Bei dem Versuch Maus-Neuroblastomzellen (N2a), welche mutiertes PrPsen exprimieren, mit drei verschiedenen TSE-Stämmen (Me7, Chandler und 79A) zu infizieren, war nur der Stamm Me7 in der Lage 3F4-getaggtes Prionprotein umzufalten. Unter den gewählten Versuchsbedingungen wurden nur die Mutanten umgefaltet, die vergleichbar mit Wildtyp 3F4 auf der Zelloberfläche detektiert werden konnten (T182N, T198A, T182N/T198A). Demnach bestätigte sich, dass für eine de novo Scrapie-Infektion einer Zelle das umzufaltende PrPsen-Molekül in ausreichender Menge auf der Zelloberfläche vorhanden sein muss.
PrP-Mutanten (T182N, T198A, T182N/T198A) mit wildtypähnlichem Verhalten wurden anschließend zur Herstellung transgener Mäuse verwendet. Zu diesem Zweck wurden PrP% -Mäuse, welche kein Prionprotein besitzen, mit dem jeweiligen Konstrukt mikroinjiziert. Das Genom der Nachkommen wurde mittels verschiedener PCR-Reaktionen auf das Vorliegen und die Kopienzahl eingebauter, transgener DNA untersucht. Die Prionprotein-Expression wurde sowohl qualitativ als auch quantitativ analysiert. Diese Mäuse überexprimierten bis zu vierfach im Vergleich zur Wildtypmaus Maus-Prionprotein und stellen so eine Infizierbarkeit versprechende Verbesserung der bisher von DeArmond et al. (DeArmond et al., 1997) publizierten Mäuse T182A, T182A/T198A dar, die bei geringer PrPsen-Expressionsrate nicht mit Scrapie infizierbar waren. In Infektionsexperimenten kann nun mittels der hier vorgestellten Mäuse ermittelt werden, wie Prionproteine in der Lage sind, allein auf der Basis einer Polypeptidkette Stammeigenschaften zu vermitteln.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this work was to elucidate the role of the glycosylation of the prion protein for the pathogenesis of the scrapie disease.
The infectious agent of this disease is postulated to be only one missfolded protein (PrPSc). Therefore, it is an intriguing question, how one protein can encipher different scrapie strains. In this context oligosaccharide-chains are discussed as a possible reason for this variety of strains. Therefore, a set of different transgenic mice was generated, which of them express mono- or diglycosylated prion protein. Earlier work (Rogers et al. 1990; Lehmann and Harris 1997) showed that the deletion of the first consensus-site for N-glycosylation leads to an aberrant synthesis of PrPsen characterized by missing surface expression. This was achieved by the substitution of threonine by alanine at codon 182. Transgenic mice carrying this mutation were resistant to scrapie infection with two different scrapie strains (DeArmond et al. 1997). On the other hand, the deletion of the second glycosylation site did neither change the trafficking of the prion protein nor the fundamental susceptibility. There was evidence in literature, that the surface expression of PrPsen is preponderance for a de novo scrapie infection of cells. Therefore, the aim was to generate transgenic mice, which express surface expressed glycosylation mutants of PrP.
The first step was to generate 20 different glycosylation mutants. All mutants were verified by sequencing, expressed in different cell-lines, and investigated by immunological and biochemical methods. Thereafter, the topology of PrP-mutants in the cell was determined by surface-biotinylation, immunocytochemical staining, digestion by Endo H and FACS-analysis. The state of glycosylation was validated by PNGaseF-digestion and westernblotting. The attachment of PrP to the cell membrane was elucidated by PIPLC-release. Last, the solubility of the mutant proteins was defined by ultracentrifugation and the existence of S-S-bridges was elucidated by biochemical methods.
After the characterization of PrPsen particular mutants were selected and investigated for their convertibility into the proteinase K-resistant isoform PrPres. For this purpose, scrapie infected cells (ScN2a-cells) were transduced using a retroviral system and cell homogenates were treated with proteinase K, ultracentrifugated, and analyzed by westernblotting. It became apparent that all of the investigated mutants (Wt3F4, T182A, T182N, T198A, T182A/T198A, T182N/T198A) were convertible. However, the unglycosylated mutant T182N/T198A showed a dominant-negative inhibition. In other words, conversion was only possible if this construct was expressed in small amounts. In the presence of many mutated proteins no conversion was found and the detectable amount of endogenous mouse-PrP was reduced. This effect has never been described before in context with mutations in this region of the protein.
The next step was to challenge Maus-Neuroblastoma cells (N2a), which express mutated PrPsen, with three different scrapie strains (Me7, Chandler and 79A). Only the challenge by scrapie strain Me7 lead to conversion of 3F4-tagged prion protein. At the chosen experimental conditions only mutants were convertible, which showed wildtype-like surface expression in tissue culture (T182N, T198A, T182N/T198A). Therefore, it was demonstrated that for a de novo infection of cells the target protein (PrP[sen]\textsuperscript{sen}) must be present on the cell surface in sufficient amount.
PrP-mutants (T182N, T198A, T182N/T198A) with wildtype-like behavior were used for the generation of transgenic mice. For this reason, PrP%-mice, missing any PrP, were microinjected with the corresponding construct. The genome of the offspring was screened by different PCR-reactions and analyzed for the existence and the copy-number of the transgene. The protein expression was analyzed in a qualitative and quantitative manner. The transgenic mice overexpressed prion protein of up to four times as much as the wildtyp-mice and promise therefore to be infectible. This result represents an improvement to the earlier published work by DeArmond et al. (T182A, T182A/T198A), whos mice showed low expression rates and low susceptibility to scrapie infection (DeArmond et al., 1997).
In addition, further infection experiments with the presented transgenic mice could help to clarify the principle how prion proteins are capable to encipher strain variety on the basis of only one single polypeptide chain.