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URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2003/1072/


Entwicklung real-time-PCR-basierter Methoden für die moderne DNA-Analytik

Development of real-time PCR based methods for modern DNA analytics

Wilhelm, Jochen


pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.203 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Quantitative PCR , Schmelzkurven , Algorithmen , Sofware , LightCycler
Freie Schlagwörter (Englisch): quantitative PCR , melting curve , algorithm , sofware , LightCycler
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biochemie (FB 08)
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.03.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 07.04.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Die molekulare DNA-Analytik ist von großer Bedeutung für die biologische und medizinische Forschung sowie zunehmend auch für die klinische Diagnostik. Hier bieten real-time-PCR-basierte Verfahren neue Möglichkeiten der schnellen und verlässlichen Quantifizierung genetischer Elemente und der einfachen Mutationsdetektion. Die vorliegende Arbeit behandelt einen Querschnitt durch das Spektrum der real-time-PCR-basiertern DNA-Analytik und gibt einen umfassenden Überblick über die theoretischen und biochemischen Grundlagen, zeigt die Einsatzmöglichkeiten für DNA-analytische Fragestellungen und stellt neue methodische Entwicklungen vor, die neue Standards bzw. Grenzen für Genauigkeit und Dynamik setzen.
Die systematische Untersuchung der Einflüsse biochemischer und technischer Parameter auf das Ergebnis von Messungen in Kombination mit Analysen theoretischer Modelle der Real-time-PCR-Prozesse erlaubt erstmals die Bestimmung möglicher Schwachstellen sowie der Grenzen für Präzision und Genauigkeit von Analysesystemen. So konnte gezeigt werden, dass die theoretisch erreichbare Genauigkeit von Quantifizierungen über CT-Werte des hier verwendeten LightCyclers bei etwa 10 % liegt. Durch die Verwendung neuer, in dieser Arbeit entwickelter Algorithmen zur Datenauswertung wird diese theoretische Grenze nahezu erreicht: Die Fehler können von mehr als 50 % nach konventioneller Auswertung auf deutlich unter 15 % gesenkt werden. Die Anwendung dieser Verfahren wurde an drei ausgewählten Fragestellungen mit tumordiagnostischem Fokus demonstriert (XIR-2, HER-2/neu und p53), die sehr unterschiedliche Ansprüche an den dynamischen Bereich und die Präzision der Quantifizierung stellen. Dabei übertrifft insbesondere die Genauigkeit des Verfahrens zur Bestimmung des Deletionsgrades von p53-Genkopien jene von anderen analytischen Methoden deutlich. Bereits der Verlust eines der beiden Allele in lediglich 25 % der Zellen einer Probe kann hochsignifikant nachgewiesen werden.
Die Algorithmen zur quantitativen Auswertung von Real-time-PCR-Daten erlauben erstmals eine optimale und vollautomatische Auswertung. Durch ein hier erstmals beschriebenes Verfahren zur Korrektur temperaturabhängiger Signaländerungen konnten die Sensitivität und die Genauigkeit von Schmelzkurvenanalysen beträchtlich erhöht werden. Die beschriebenen Algorithmen wurden in einer neuen, sehr anwenderfreundlichen Software (SoFAR) implementiert.
Schließlich werden mehrere neuartige Verfahren zum Einsatz der Real-time-PCR vorgestellt: Ein Verfahren erlaubt die sehr genaue Bestimmung von Genomgrößen, wie am Beispiel von S. cerevisiae (12.1 MBp), H. sapiens (2.9 GBp) und X. maculatus (551 MBp) gezeigt ist. Ein weiteres Verfahren beruht auf einer allelspezifischen Real-time-PCR und kann zur einfachen Genotypisierung sowie zur Chimärenanalytik eingesetzt werden, wie am Beispiel der klinisch relevanten SNPs von PAI-1 und F7c gezeigt. Die erreichten dynamischen Bereiche zur Unterscheidung kleiner Polymorphismen sind hier über 100mal größer als die konventioneller Verfahren. Mit dem neuen Verfahren zur kompetitiven Real-time-PCR sind hochgenaue Konzentrationsbestimmungen möglich. Mit dieser Methode wurde die Menge der cDNA von BCR/ABL-Fusionstranskripten in Einzelbestimmungen mit einem Fehler von weniger als 3 % bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit steigern die Leistungsfähigkeit, Verlässlichkeit und Genauigkeit der Ergebnisse von Real-time-PCR-Experimenten und erweitern die möglichen Anwendungsbereiche der Real-time-PCR für DNA-analytische Fragestellungen. Die entwickelten Verfahren bereichern das methodische Arsenal der molekularen Genetik und Medizin.
Kurzfassung auf Englisch: The molecular analysis of DNA is of great importance for biological and medical research as well as for clinical diagnostics. As on of its routine procedures, real-time PCR based assays provide new measures for robust, reliable, and highly accurate quantifications of nucleic acids and mutation detection. This work testifies real-time PCR and gives a profile of its important theoretical and biochemical elements, displays some potential diagnostic fields of use and introduces new methods which define new limits of accuracy and dynamic ranges.
The systematic analysis of biochemical and technical parameters and their influence on the measurements in combination with analysis of theoretical models of the real-time PCR process allow the determination of possible weak spots and the limits of precision and accuracy of an instrument. It could be shown that the theoretical upper limit for accuracy of the LightCycler instrument is 10 % in standard quantification experiments. Using the manufacturer's software, accuracies of 30-50 % are usual. After applying the new algorithms of data evaluation developed in this work, the theoretical upper limit of accuracy is nearly reached. The performance of this application was demonstrated on three selected targets with a focus on tumor diagnostics (XIR-2.5, HER-2/neu and p53) which are differently demanding for precision and dynamics. For example, the loss of one of the two allelic copies per cell in only 25 % of the cells in a sample can be detected with high significance.
The algorithms developed for the first time effort an optimal and fully automatic evaluation. New algorithms for the correction of temperature dependent changes of fluorescence signals considerably increased the sensitivity and accuracy of quantitative melting curve analyses. The algorithms described have been implemented in an user-friendly software called SoFAR.
Finally, several new real-time PCR based assays are also presented one of which allows a highly accurate determination of genomic sizes as demonstrated for S. cerevisiae (12.1 Mbp), H. sapiens (2.9 Gbp) und X. maculatus (551 Mbp). Another assay, based on allele-specific amplification can be used for chimerism analysis. It was established on two clinically relevant SNPs in the promoter regions of the genes PAI-1 and F7c. The dynamic ranges obtained here are more than 100fold larger than those of conventional assays. Quantification with extremely high precisions is possible with the third method described, which is a competitive real-time PCR. It could be shown, that the single measurements of the cDNA content of bcr/abl fusion transcript with errors of less than 3 % are possible.
The results of this work increase the efficiency, reliability, and accuracy of the results of real-time PCR experiments, extend the possible fields of use of this technology and enrich the collection of methods of molecular genetics and medicine.