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Expression von Holophytochrom in Escherichia coli

Landgraf, Frank Thomas


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Phytochrom , Escherichia coli , Cph1 , PcyA
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Allgemeine Botanik und Pflanzenphysiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2003
Erstellungsjahr: 2003
Publikationsdatum: 12.05.2003
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel der Arbeit war es, die in-vivo Holophytochromsynthese in E.coli zu etablieren, um ausreichend in-vivo assembliertes Holophytochrom herstellen zu können. Ferner kann die Methode für Untersuchungen im Rahmen eines random-mutagenesis screening Verfahrens nutzbar gemacht werden. Die Etablierung dieser Methode ist für einen entsprechenden Ansatz in S.cerevisiae von Vorteil, da dadurch die Möglichkeit entsteht, nach Phytochrom Interaktionspartnern mittels der Hefe-2-Hybrid Methode unter Berücksichtigung des Pr/Pfr-Zustandes von Phytochrom zu suchen.

Um Holophytochrom zu bilden, wurden die entsprechenden Gene aus Synechocystis PCC 6803 (cph1, ho und pcyA) zur Expression gebracht. Daraufhin konnte erstmals lösliches Holo-Cph1 gebildet werden. Bei näheren Analysen fiel eine hypsochrome (Blau-) Verschiebung von ~5-nm auf, die nur bei einer in-vivo, jedoch nicht bei einer in-vitro-Assemblierung auftrat.

Durch SDS-PAGE Analysen wurde die Präsenz eines Fusionsproteins aus HO und PcyA festgestellt, welches aufgrund der sup-Eigenschaft von E.coli (XL1-blue) zustandegekommen war. Durch die Wahl eines entsprechenden sup- E.coli-Stammes konnte die Bildung eines Fusionsproteins verhindert werden. Das Fusionsprotein ergab zwar ein farbliches Pigment, jedoch konnte dieses Pigment kaum mit dem dargebotenen Apo-Cph1 assemblieren.

Durch die in-vivo-Assemblierung von Apo-Cph1 mit Phycocyanobilin konnte jedoch nicht die schon für das Apoprotein und für in-vitro assembliertes Holo-Cph1 beobachteten Aggregationstendenzen nach Aufschluss der Bakterien verhindert werden. Um diese Aggregationen zu unterbinden, wurde die Co-Expression von molekularen Chaperonen (sHSP und GroE-L/S) untersucht. Die Expression der oben erwähnten molekularen Chaperonen konnte die Löslichkeit von Holo-Cph1 in vivo nicht verbessern und die Aggregationsbildung in-vitro nicht unterbinden.

Durch Deletion des C-Terminus (Histidin-Kinase-Domäne) von Cph1 entsteht ein Konstrukt (Cph1delta2), das in-vitro nicht mehr aggregiert. Cph1delta2 ergab nach Co-Expression mit HO und PcyA ebenfalls vollständig in-vivo assembliertes Holophytochrom und konnte nach einer optimierten Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu einem hohen Grad aufgereinigt werden, was sich an dem im UV-Vis gemessenen Absorptionsverhältnis von 1.16 wiederspiegelt.