Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-8638
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2002/863/


Entwicklung und Wirksamkeitsprüfung eines Impfstoffes zur aktiven Immunisierung gegen das Clostridium perfringens Alphatoxin

Neubauer, Axel


pdf-Format: Dokument 1.pdf (1.005 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.06.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 05.12.2002
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob die atoxischen gentechnisch hergestellten Alphatoxinvarianten (rAT) 121A/91
und 121A/91-His212 die zur Immunisierung gegen das C. perfringens Alphatoxin Verwendung finden können. Das rAT121A/91 ist das
rekombinante Analog der atoxischen Alphatoxinvariante 121A/91, die vom natürlich vorkommenden C. perfringens Feldisolat 121A/91
sezerniert wird. Die Variante 121A/91-His212 ist durch in vitro Mutagenese aus dem AT121A/91 hervorgegangen. Hierbei wurde das
Arginin an Position 212, entsprechend der Wildtyptoxin-Sequenz, durch ein Histidin ersetzt. Studien mit den beiden rekombinanten
Varianten und dem Alphatoxinspezifischen monoklonalen Antikörper 3B4 zeigten, daß die Alphatoxinvariante 121A/91- His212 eine
höhere Bindungsaktivität gegenüber dem monoklonalen Antikörper aufweist als das rAT121A/91. Dies läßt darauf schließen, daß sich das
His212 in einem für die Bindung essentiellen Aminosäurebereich befindet.

Die beiden Alphatoxinvarianten ließen sich effektiv in E. coli pASK-IBA2-Expressionsvektoren exprimieren und
affinitätschromatographisch aus dem Periplasmaextrakt aufreinigen. Die Alphatoxinvarianten waren bei Immunisierungsversuchen in der
Maus gut verträglich. Bei der Verwendung der Impfkandidaten in MF59, einem Öl in Wasser Adjuvans, traten bei der s.c. Immunisierung
keine und bei der i.p. Applikation nur geringgradige Allgemeinstörungen auf. Die s.c. Vakzinierung mit dem durch in vitro Mutagenese
gewonnenen rAT121/91-His212 in Alu-Gel führte hingegen zu entzündlichen Veränderungen an der Applikationsstelle.

Im ELISA konnte gezeigt werden, daß die i.p. Immunisierung mit beiden Varianten in MF59 zu Alphatoxin-spezifischen Antikörper Titern
von 1: 1.024.000 führte. Obwohl sich die Titer nicht in ihrer Höhe unterschieden, konnte im in vitro Hämolyse-Neutralisationsassay
nachgwiesen werden, daß die mit dem rAT121A/91-His212 induzierten Antiseren eine stärkere antihämolytische Wirkung aufwiesen.
Da die intraperitoneale Applikation auf die Anwendung im Mausmodell begrenzt ist, wurde das rAT121A/91-His212 zudem bei subcutaner
Immunisierung getestet. In Kombination mit MF59 führte dies zu vierfach geringeren Antikörperkonzentrationen als nach intraperitonealer
Immunisierung. Trotz niedrigerer Alphatoxin-erkennender Antikörpertiter war der Anteil antihämolysierender Antikörper jedoch um den
Faktor zwei höher, als nach entsprechender i.p. Immunisierung.

Die enzymatische Aktivität des Alphatoxins konnte mit beiden Seren in Kombination mit MF59 unabhängig vom Applikationsweg
neutralisiert werden. Die Seren, die mit Alu-Gel als Adjuvans bzw. ohne die Zugabe eines Adjuvans gewonnen worden waren, besaßen
keine PLC-inhibierende Wirkung.

Im Toxinchallenge-Versuch war das rAT121A/91-His212 dem rAT121A/91 eindeutig überlegen. Bei der Verwendung von
rAT121A/91-His212 in Kombination mit MF59 überlebten bei i.p. Immunisierung bis zu 76% und bei s.c. Applikation bis zu 42% der Tiere
die Belastung mit dem Wildtyptoxin. Bei den Tieren der Adjuvanskontrollen betrug die maximale Überlebensrate 17%. Die i.p.
Immunisierung mit rAT121A/91 in MF59 führte hingegen nicht zu einer nachweisbaren Schutz der Tiere.

Die im in vivo Belastungsversuch gewonnenen Ergebnisse wurden in einem in vitro Neutralisationsversuch bestätigt. Hierbei wurde mit
Antiserum präinkubiertes Alphatoxin Mäusen intraperitoneal appliziert. Nur Tiere, denen ein Gemisch aus Alphatoxin mit durch i.p.
Immunisierung von rAT121A/91-His212 in MF59 gewonnem Serum injiziert wurde, überlebten.

Nach Vakzinierung von Mäusen mit dem durch in vitro Mutagenese gewonnenen rAT121A/91-His212 gelang es, Antiseren zu gewinnen,
die sowohl die enzymatische Aktivität, als auch die hämolytische Wirkung des Alphatoxins neutralisierten. Die intraperitoneale
Vakzinierung mit der Alphatoxinvariante und einem Öl in Wasser Adjuvans war zudem geeignet, die letale Wirkung des Wildtyptoxins
sowohl im in vitro Neutralisationsassay als auch im in vivo Belastungsversuch vollständig zu inhibieren bzw. signifikant zu reduzieren. Das
rAT121A/91-His212 ist somit ein Impfantigen, das sich für eine aktive Immunisierung gegen das Alphatoxin von C. perfringens eignet.

Kurzfassung auf Englisch: The goal of the present study was to determine the suitability of two non-toxic recombinant Clostridium perfringens alphatoxin variants
(rAT), 121A/91 and 121A/91-His212, for use as potential vaccines. The rAT121A/91 is the recombinant analogue of the naturally occurring,
non-toxic variant 121/91A. The 121A/91-His212 was constructed from 121/A91 using in vitro mutagenesis. The Arg at position 212 was
substituted for a His residue to mimic the toxin sequence of the wild type toxic alphatoxin.
Studies examining the binding of the alphatoxin-specific monoclonal antibody 3B4 indicated more mab 3B4 bound to the 121A/91-His212
protein than the 121A/91 protein. This indicates that the His 212 residue is located in a region which is essential for mab 3B4 binding.
Both variant alphatoxins could be effectively expressed using E. coli pASK-IBA2-expression vectors and were purified from the periplasmic
extract.

Immunisations with the alphatoxin variants were well tolerated by mice. Combined with the oil-in-water emulsion MF59, the IP immunisation
resulted in a slight reaction measured by change in the condition of the mice and no change was seen with the SC immunisation. The
rAT121A/91-His212 was also combined with aluminum gel and given by the SC route. This immunisation resulted in an inflammatory
reaction at the injection site.

Sera from mice immunised IP with either of the variant alphatoxins in MF59 were tested in an ELISA and in an in vitro haemolysis
neutralisation assay. This route of immunisation induced ELISA anti-alphatoxin titres of 1:1,024,000. Although the magnitude of the ELISA
titre was the same for both variants, the rAT121A/91-His212 variant induced anti-sera with higher anti-haemolytic activity. As the IP
immunisation is restricted to the mouse model, SC vaccination was also evaluated. Using this route with rAT121A/91-His212 and MF59
resulted in four-fold lower ELISA titres than induced by the IP immunisation. However, the antihaemolytic activity of the sera induced by the
SC immunisation were twice the magnitude of the IP immunisation.

Sera from the immunised mice were also tested for the ability to inhibit the enzymatic cleavage of alphatoxin substrates. Sera from mice
immunised with either variant and MF59 were able to inhibit this reaction, however sera from aluminum gel adjuvanted vaccine groups or
non-adjuvanted groups did not inhibit PLC-hydrolysis.

In toxin challenge assays the rAT121A/91-His212 was clearly superior to the rAT121A/91. When the animals were vaccinated using the
MF59 adjuvant, survival rates for the rAT121A/91-His212 variant were 76% for the IP vaccinated group and 42% for the SC vaccinated
group. Immunisation with the rAT121A/91 variant in MF59 did not produce any enhancement of survival when compared to the adjuvant
controls. In these studies the highest survival rate in the adjuvant controls was 17%.
The results from the in vivo challenge studies were verified by an in vitro neutralisation assay. In this assay alphatoxin is pre-incubated with
antiserum prior to injection into mice. The results of this study showed that only animals that were injected with alphatoxin, which had been
pre-incubated with anti-sera from rAT121A/91-His212 and MF59 immunised animals, survived.
After the vaccination of mice with the construct rAT121A/91-His212, which was obtained through in vitro mutagenesis, anti-sera that
neutralised the enzymatic activity and the haemolytic activity of C. perfringens alphatoxin were induced. The intraperitoneal immunisation
using this construct and an oil-in-water adjuvant inhibited the lethal effects of the wild-type toxin in in vitro neutralisation assays and
significantly reduced it in vivo challenge assays. This shows that the rAT121A/91-His212 variant can be used for the active immunisation
against the alphatoxin of C. perfringens.