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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-8602
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Schnelle und einfache Bestimmung der Genotypen des Hepatitis B Virus durch eine Multiplex-PCR

Kirschberg, Oliver


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Zentrum für Medizinische Mikrobiologie und Virologie, Institut für Medizinische Virologie des Universitätsklinikums
Fachgebiet: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.11.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 19.11.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der Arbeit war es eine einfache und zeitsparende Methode zu etablieren, die in der Lage war, die heute bekannten sieben
Genotypen des Hepatitis B Virus zu erkennen. Zu Beginn der Arbeit wurde versucht eine publizierte Methode zu verbessern. Bei der
verwendeten Multiplex-PCR wurden die HBV-Genotypen A, C, D und F diskriminiert. Nach unveröffentlichten Ergebnissen sollte auch noch
der Genotyp E erkannt werden. Um diese Multiplex-PCR zu verbessern, wurde ein spezifischer Primer für den Genotypen B getestet. Zwar
gelang der spezifische Nachweis eines Genotyp-B-Isolates wodurch alle zum damaligen Zeitpunkt bekannten Genotypen A-F in einer
Multiplex-PCR nachweisbar waren; aber die Methode erwies sich für die Routinediagnostik als zu störungsanfällig.


Deshalb wurde mit einem etwas anderen methodischen Ansatz eine neue Multiplex-PCR entwickelt, die in einem Reaktionsansatz die
heute gängigen sieben HBV-Genotypen zu differenzieren vermochte. Mit Hilfe verschiedener Computerprogramme wurden sieben
Primerpaare entwickelt, die die gleiche vorhergesagte Annealingtemperatur aufwiesen. In umfangreichen Experimenten wurden dann die
verschiedenen Parameter wie Annealing- und Elongationstemperaturen, Zykluszeiten, verschiedene Thermocycler sowie verschiedene
hitzestabile Polymerasen optimiert. Unter den gefundenen Bedingungen erwies sich die Multiplex-PCR als hochspezifisch. Eine
Genotypisierung gelang nicht nur mit HBV-DNA haltigen Plasmiden, sondern auch in einer kleinen Auswahl von Patientenseren mit durch
Sequenzierung bekanntem Genotyp. Auch die Empfindlichkeit des System war mit 103-104 Genomäquivalenten pro ml befriedigend.


Nunmehr steht ein System zur Verfügung, welches seinem Ziel - der einfachen und schnellen HBV-Genotypisierung – gerecht wird.