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Identifizierung und weitergehende Charakterisierung von ß-hämolysierenden Streptokokken, isoliert von Seehunden und Kegelrobben aus der deutschen Nord- und Ostsee

Vossen, Arndt J.


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Milchwissenschaften
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.09.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 27.09.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Die vorliegenden Untersuchungen ermöglichten eine Identifizierung und weitergehende Charakterisierung von 72 hämolysierenden
Streptokokken, isoliert von Seehunden und Kegelrobben aus der deutschen Nord- und Ostsee. Aufgrund kultureller, biochemischer,
serologischer und auch molekularer Untersuchungen konnten 69 Kulturen als S. phocae und drei Kulturen als S. dysgalactiae subsp.
dysgalactiae Serovar L identifiziert werden. Dies ist der erste Nachweis über das Vorkommen der Spezies S. phocae bei Kegelrobben.
Von den 69 S. phocae-Kulturen wurden acht Kulturen der serologischen Gruppe C und 61 Kulturen der serologischen Gruppe F
zugeordnet. Einige typische biochemische Eigenschaften der untersuchten S. phocae-Kulturen waren eine positive Fructose-, D-Mannose-
und Ribose-Reaktion sowie der fehlende Abbau von Lactose, Salicin, Sorbit, Trehalose, Äskulin, Arginin und Na-Hippurat.


Eine molekulare Charakterisierung der S. phocae-Isolate erfolgte, nach Sequenzierung, durch Amplifizierung des 16S ribosomalen
RNA-Gens. Die Restriktionsmuster unter Verwendung der Restriktionsenzyme EarI und HincII erwiesen sich als speziesspezifisch. Eine
zweite Strategie zum PCR-vermittelten Nachweis lag in der Entwicklung von S. phocae-spezifischen Oligonukleotidprimern, die unter
Einbeziehung der S. phocae-spezifischen V2-Region entwickelt wurden. Mit diesen speziesspezifischen Oligonukleotidprimern war eine
eindeutige Spezieszuordnung aller 69 S. phocae-Kulturen sowie der S. phocae-Referenzkulturen möglich.


Weitere phänotypische Eigenschaften der überwiegenden Zahl der S. phocae-Kulturen waren eine lange streptokokkentypische
Kettenformationen, ein Wachstum in Flüssigmedium mit wattigem bis körnigem Bodensatz bei gleichzeitig klarem Überstand, ein
kompaktes Wachstum in Soft-Agar und eine Aggregation mit einer Ammoniumsulfatkonzentration von 0,1 mol/l. Die S. phocae-Kulturen
waren ferner empfindlich gegenüber den meisten untersuchten Antibiotika.


DNA-Fragmentmuster von 66 S. phocae-Kulturen konnten durch Makrorestriktionsanalyse der chromosomalen DNA der Kulturen mittels
Pulsfeldgelelektrophorese erstellt werden. Dies ergab 29 verschiedene DNA-Fragmentmuster. Es konnten überwiegend keine
Übereinstimmungen der DNA-Fragmentmuster festgestellt werden. Kreuzinfektionen zwischen einzelnen Tieren scheinen somit eher selten
aufzutreten. DNA-"Fingerprints" der isolierten S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae Serovar L-Kulturen ergaben einen deutlichen
Unterschied von Isolaten aus der Nord- und Ostsee. Im Weiteren zeigte ein L-Streptokken-Nordsee-Isolat, isoliert von einem Seehund und
ein vergleichsweise untersuchtes L-Streptokokken-Isolat von einem Schweinswal aus der Nordsee, eine teilweise Verwandtschaft. Das
Vorkommen beider Tierarten im selben Habitat, lässt eine Übertragung der L-Streptokokken vermuten.
Kurzfassung auf Englisch: The present study allowed an identification and further characterisation of 72 ß-haemolytic streptococci isolated from harbour seals and
grey seals of the German North and Baltic Seas. As a result of cultural, biochemical, serological and also molecular methods 69 bacterial
cultures could be identified as S. phocae and three cultures as S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae Serovar L. This is the first evidence of
the species S. phocae occurring in grey seals. Eight of the 69 S. phocae-cultures belonged to the serological group C and 61 cultures to
the serological group F. Some typical biochemical properties of the S. phocae-cultures, investigated in the present study, were a positive
fructose, D-mannose and ribose reaction as well as a missing reaction with lactose, salicin, sorbitol, trehalose, esculin, arginine and
hippurate.


A molecular characterisation of the S. phocae-isolates resulted from an amplification of the 16S ribosomal RNA-gene after sequencing.
The amplicons were proven to be species specific using the restriction enzymes EarI and HincII. A second strategy for a PCR arranged
species identification were the design of S. phocae-specific oligonucleotide primers in consideration of the S. phocae-specific V2-region.
Using this species specific oligonucleotide primers a clear species affiliation of all 69 S. phocae-cultures as well as the
S. phocae-reference cultures were possible.


Further phaenotypic properties of most of the S. phocae-cultures were a long streptococci typical chain formation, growing as a
cotton-granular sediment in fluid media with a simultaneously clear supernatant, compact growing in soft agar and an aggregation reaction
in a 0,1 mol/l ammonium sulfate concentration. In addition the S. phocae-cultures were susceptible to most of the antibiotics investigated.


DNA-fragment patterns of 66 S. phocae-cultures were created by macrorestriction analysis of chromosomal DNA of the bacterial cultures
using pulsed-field gel electrophoresis. This resulted in 29 different DNA-fragment pattern. Predominantly there was no consistence of the
DNA-fragment patterns realised. Consequently cross infections between particular animals seems to occur rarely. DNA-fingerprints" of the
isolated S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae Serovar L-cultures resulted in an obvious distinction of isolates from the North and Baltic
Seas. Furthermore a group L-streptococci-North Sea-isolate, isolated from a harbour seal, showed a partial relationship to a comparatively
investigated group L-streptococci-isolate from a harbour porpoise of the North Sea. The occurrence of both animal species in the same
habitat might have caused a transmission of the group L-streptococci.