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Lys 691 , a predicted phosphate coordination site, and Asp 714 , a predicted water coordination site of the sodium pump a alpha subunit are essential for enzyme activity

Su, Ping


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie und Endokrinologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.07.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 09.08.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Die Natriumpumpe, eine P-Typ-ATPase, scheint zur Superfamilie der Hydrolysen zu gehören.Aufgrund ihrer Faltungsstruktur müßte sie als
L-2-Haloazid-Dehalogenase klassifiziert werden. In der Haloazid-Dehalogenase L-2-DEX YL dient die Aminosäure Lys151 der
Stabilisierung der überschüssigen negativen Ladung bei der Substratbindung bzw. der Entstehung von Reaktions-Zwischenprodukten.
Asp180 koordiniert ein Wassermolekül, welches direkt bei der Hydrolyse des Ester-Intermediats beteiligt ist. Die beiden Aminosäuren
könnte Lys691 und Asp714 der Natriumpumpe entsprechen. Um ihre Bedeutung für die Katalyse zu untersuchen, wurden Mutanten dieser
Aminosäuren in Hefezellen exprimiert und ihre Eigenschaften untersucht.


Die Mutationen Lys691Ala, Lys691Asp, Asp714Ala, und Asp714Arg waren völlig inaktiv. Die konservativen Mutanten Lys691Arg und
Asp714Glu zeigten einige Teil-aktivitäten des Wildtyp-Enzyms, waren aber ohne ATPase-Aktivität. In Anwesenheit von Pi und Mg 2+ zeigte
keine der Mutanten eine Ouabainbindung: Der [E2*P·ouabain] Komplex konnte bei keiner der Mutanten gebildet werden. Ohne Zugabe von
Mg 2+ zeigten die Lys691Asp- und Asp714Glu-Mutanten jedoch eine Ouabainbindung bei 5 mM Pi. Somit bewirkte Mg 2+ eine Reduktion
der Ouabainbindung.


Hefezellen, welche die Mutanten Lys691Arg oder Asp714Glu exprimierten, waren sensitiv gegenüber Palytoxin und verloren K + . Ihre
Sensitivität gegenüber Palytoxin, mit einem EC50 Wert von 118 ± 24 nM bzw. 76,5 ± 3,6 nM war deutlich reduziert und lag sieben- bzw.
vierfach unter der Sensitivät von Hefezellen, die den Wildtyp exprimierten (17,8 ± 2,7 nM). Dieser Palytoxin-induzierter K + -Efflux wurde
durch Ouabain gehemmt. Der EC50 Wert für den Ouabaineffekt betrug 131 ± 13 µM bei der Lys691Arg Mutanten und war 2,5 mM oder
größer bei der Asp714Glu Mutanten. Der entsprechende EC50 Wert nicht-mutierter Natriumpumpen lag bei 5.13 ± 0.71 µM.


Isotopenaustauschexperimente mit 18 O-markiertem Pi zeigten bei der Mutanten Asp714Glu nur einen geringen 18 O Austausch mit dem
Umgebungswasser (H2 16 O) und keinen 18 O Austausch bei der Lys691Arg Mutante.


Schlussfolgernd, Lys691 und Asp714 sind sehr wichtig für die Konformationsübergänge der Natriumpumpe. Das Lys691 ist wichtig für den
Phosphorylierungsprozess, Asp714 für den Dephosphorylierungsprozess. Beide Aminosäuren Lys691 und Asp714 der alpha Untereinheit
der Natriumpumpe sind hier als essentiell für die enzymatische Aktivität nachgewiesen worden.
Kurzfassung auf Englisch: P-type ATPases such as the sodium pump appear to be the members of a superfamily of hydrolases structurally typified by the
L-2-haloacid dehalogenases. In the haloacid dehalogenase L-2-DEX YL, Lys151 serves to stabilize the excess negative charge in the
substrate/reaction intermediates and Asp180 coordinates a water molecule that is directly involved in ester intermediate hydrolyze. To
investigate the importance of the corresponding Lys691 and Asp714 of the sodium pump a subunit, sodium pump mutants were expressed
in yeast and analyzed for their properties.


The Lys691Ala, Lys691Asp, Asp714Ala, and Asp714Arg mutants were enzymatic inactive, not only with respect to ATPase activity, but
also to non interaction with the highly sodium pump-specific-inhibitors ouabain or palytoxin.


In contrast, the conservative mutants Lys691Arg and Asp714Glu retained some of the partial activities of the wild-type enzyme, although
they completely failed to display any ATPase activity. In the presence of Pi and Mg 2+ , none of the mutant sodium pumps were able to bind
ouabain: the [E2*P·ouabain] complex was not able to be formed by the mutant enzymes.When Mg 2+ was omitted, however, both
Lys691Asp and Asp714Glu mutants displayed ouabain binding only at 5 mM Pi. Mg 2+ caused a reduction in ouabain binding with an EC50
of 0.76 ± 0.11 mM and 1.24 ± 0.21 mM, respectively.


On the other hand, yeast cells expressing Lys691Arg and Asp714Glu mutants are sensitive to palytoxin and lose their intracellular K + .
Their sensitivity to palytoxin, with EC50 value of 118 ± 24 nM and 76.5 ± 3.6 nM, respectively, was clearly reduced by almost 7- or 4-fold
below that of the native sodium pump (17.8 ± 2.7 nM).


In contrast to the binding experiments in the presence of Mg 2+ and phosphate, ouabain was recognized by the mutants under these
conditions and inhibited the palytoxin-induced K + efflux from the yeast cells. The EC50 for the ouabain effect was 131 ± 13 µM for
Lys691Arg, and greater than 2.5 mM for the Asp714Glu mutant, while the corresponding value obtained with cells expressing the native
sodium pump was 5.13 ± 0.71 µM.


Experiments with 18 O-labeled Pi demonstrated that only a modest 18 O exchange with surrounding water occurred for Asp714 and no 18 O
exchange was detected with the Lys691Arg mutant.


In conclusions, Lys691 and Asp714 are very important for the conformational transition of the sodium pump: Lys691 is essential for the
phosphorylation process and Asp714 for the dephosphorylation process. Thus, Lys691 and Asp714 residues of the sodium pump alpha
subunit are essential for the enzymatic activity.