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Nachweis von zentralnervösem Gewebe in Lebensmitteln im Hinblick auf die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)

Horlacher, Sabine


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkundeder
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.06.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 06.08.2002
Kurzfassung auf Deutsch: m Hinblick auf die Problematik der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) und der daraus erwachsenden Sensibilisierung des
Verbrauchers bezüglich der Zusammensetzung der Fleischerzeugnisse ist es notwendig, der Lebensmittelüberwachung ein geeignetes
Kontrollverfahren der Roh- und Endprodukte an die Hand zu geben. Vorrangig ist die Einhaltung des Verarbeitungsverbots von Gewebe
des zentralen Nervensystems (ZNS) in Lebensmitteln, da dies als Hauptinfektionsquelle der BSE angesehen wird. In der vorliegenden
Arbeit wurde deshalb der Nachweis von zentral-nervösem Gewebe in rohen sowie hitzebehandelten Fleischerzeugnissen mittels
Cholesterol-Screening sowie immunchemischer Proteindetektion systematisch untersucht.


Die Bestimmung des Cholesterolgehalts ist ein einfach durchzuführendes Verfahren, das jedoch aufgrund seiner relativ geringen Spezifität
und der hohen Schwankungsbreite der Meßergebnisse lediglich als Screeningmethode geeignet ist. Zur Beurteilung der Cholesterolwerte
wurde anhand der ermittelten Meß-daten der ZNS-negativen Proben ein maximaler normaler Grenzwert, ein sogenannter Cutoff-Point (CP),
berechnet. Dieser lag bei allen Fleischerzeugnissen mit Ausnahme von Leberwürsten bei 108 mg Chol-esterol/100 g Frischsubstanz (FS)
mit einer statistischen Sicherheit von 75 %. Aufgrund des Leberanteils lag der Cutoff-Point für Leberwürste bei 152 mg/100 g FS (p=0,25).
Im Hinblick auf die geringe statistische Sicherheit muß man jedoch mit einer hohen Anzahl von falsch positiven Verdachtsproben im
Cholesterol-Screening-verfahren rechnen. Deshalb sind spezifischere Methoden für den Nachweis von ZNS in Lebensmitteln notwendig. In
der vorliegenden Arbeit wurde hierzu das immunchemische Verfahren verwendet.


Als Marker dienten die neuronen-spezifische Enolase (NSE) sowie das Saure Gliafaserprotein (GFAP). Beide sind hoch spezifisch für das
zentrale Nervensystem, jedoch ist die Auswertung der NSE-Banden einfacher als die der GFAP-Banden. Unter Berücksichtigung der
NSE-Ergebnisse und der optimierten Extraktion durch Zusatz von 2-Mercaptoethanol und 1,4-Dithio-D,L-threitol (DTT) wurden in erhitzten
Fleischerzeugnissen noch 0,1 % ZNS-Gehalte in der Probe nachgewiesen. Bei nicht erhitztem Material konnten sogar bis 0,01 %
ZNS-Zusätze festgestellt werden. Insgesamt erwiesen sich von 661 rohen sowie hitzebehandelten Fleischerzeugnissen 9 % als für den
Zusatz von ZNS immunchemisch positiv.


Die Erhitzung von Fleischerzeugnissen, insbesondere bei Leberwürsten, führte zu einer exponentiellen Reduktion der NSE-Immunaktivität,
nicht jedoch des Cholesterolgehaltes. Mit Hilfe schwefelhaltiger Extraktionsmittel, insbesondere Mercaptoethanol in Verbindung mit DTT,
konnte die NSE-Immunintensität der Proben reaktiviert werden. Dies ist vor allem bei hitzekonservierten Fleischerzeugnissen von
Bedeutung. Während hier die Tris-Harnstoff-Extraktion bei Proben, die im Cholesterol-Screening positiv beurteilt wurden, häufiger negative
NSE-Reaktionen lieferte, wurde nach dem Zusatz von Mercaptoethanol und DTT zum herkömmlichen Extraktionsmittel eine teilweise stark
ausgeprägte Immunreaktion erkennbar. Bei Referenzmaterial ohne Zusatz von ZNS war dagegen bei gleicher Behandlung weder eine
NSE- noch eine GFAP-Reaktion erkennbar. Eine weitere Empfindlichkeitssteigerung des Westernblotverfahrens konnte durch die
Aufkonzentrierung der Probenextrakte erreicht werden.


Im Sinne des vorbeugenden Verbraucherschutzes ist die Anwendung der vorgestellten Methode zur Detektion von ZNS-Zusätzen in
Fleischerzeugnissen im Rahmen einer Endproduktkontrolle zu empfehlen. Dabei ist dem Westernblotverfahren gegenüber dem
Cholesterol-Screening, insbesondere unter Berücksichtigung der geringen Spezifität, bei mäßig erhitzten Wursterzeugnissen, der Vorzug
zu geben. Die fehlende Nachweisbarkeit der Tierart sowie des Alters, als häufigsten Kritikpunkt, ist im Hinblick auf die allgemeine
Verbrauchervorstellung von Fleischerzeugnissen sowie die geänderten Leitsätze für Fleisch und Fleischerzeugnisse des Deutschen
Lebensmittelbuches vernachlässigbar
Kurzfassung auf Englisch: In view of the crisis caused by bovine spongiform encephalopathy (BSE) and the growing sensibility of the consumer as pertaining to the
composition of retail meat products, it was necessary to develop suitable analytical methods for official food control. First priority must be
given to the ban on tissues on the central nervous system (CNS) as CNS is regarded as the main source of infection with the BSE agent. In
the present study the detection of tissues of the CNS by means cholesterol quantification and immunochemical analysis of CNS specific
proteins was systematically investigated in raw and heated meat products.


The quantification of cholesterol is a method easy to apply in routine food control. Therefore, it is suitable as screening method despite low
specificity and the relatively high differences between measurements. In order to asses the results of cholesterol analysis of the samples, a
normal maximum cholesterol content of cooked sausages, the cutoff point (CP), was calculated on the basis of the data from CNS negative
sausages in this investigation. In this study upper limits (CP) of 108 mg cholesterol/100 g of fresh products for all meat products without liver
addition with a statistical security of 75 % were established. The cutoff point for liver sausages was 152 cholesterol mg/100 g (p=0.25). The
low statistical security will cause a relatively high number of false positive suspicious samples when using cholesterol quantification for
detection of CNS. This fact necessitates the availability of more specific methods. In the own studies immunochemical methods were used
which facilitated highly specific and sensitive CNS detection in meat products.


As markers, neuron specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) were used. Both are highly specific for the central
nervous system, however, interpretation of the NSE-immunoblot was easier as that of the GFAP-immunoblot. Using NSE as marker and the
optimised extracting buffer with 2-Mercapto-ethanol and 1,4-Dithio-D,L-threitol the lowest detectable amount of CNS tissue in heated meat
products was 0.1 %. In non heated material 0.01 % CNS addition could still be detected. Taking all the 661 raw as well as heated meat
products together 9 % showed a positive CNS reaction in the westernblot.


Whereas the heating of retail meat products, in particular of liver sausages, caused an exponential reduction of the NSE immunoresponse,
cholesterol content was not reduced. After extracting the proteins with trisurea buffer with Mercaptoethanol and 1,4-Dithio-D,L-threitol (DTT)
the NSE immunoresponse could be reactivated. In particular this proved to be necessary in strongly heated canned samples. In such
samples, which were analysed positive in the cholesterol screening, the trisurea extraction buffer gave negative NSE reactions frequently.
By use of Mercaptoethanol and DTT in the conventional extracting buffer immunoreactions became not only recognisable but were
sometimes intensely pronounce. On the other hand reference material without the addition of CNS tissue showed neither a NSE- nor a
GFAP-reaction. A further increase of the sensitivity of the immunochemical analysis could be achieved by the concentration of the sample
extracts.


According to the principles of preventive consumer protection the application of the presented methods in official food control for detection
of CNS tissues in retail meat products is well suitable. The immunochemical analysis of CNS specific proteins should have the distinction of
the cholesterol screening, in particular with consideration of the low specificity, in moderate heated sausages. The test cannot detect the
species or age of the animal the CNS was derived of, however, this is not essential when considering the consumer expectation of meat
products and the modified German Food Code.