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Identification and further characterization of Streptococcus uberis and Streptococcus parauberis isolated from bovine milk samples

Khan, Izhar ul-haq


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Professur für Milchwissenschaften am Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 22.07.2002
Kurzfassung auf Deutsch: In den vorliegenden Untersuchungen wurden 130 S. uberis- und eine S. parauberis-Kultur, isoliert aus Kuhmilchproben von 59
unterschiedlichen Betrieben aus verschiedenen Regionen Hessens (Deutschland), sowie vier Referenzstämme beider Spezies
vergleichend kulturell, biochemisch und serologisch untersucht. Sowohl die S. uberis- als auch die S. parauberis-Kulturen zeigten im
allgemeinen kein Wachstum auf Enterokokken-Selektivnährmedium und wuchsen auf Schafblutagar alpha- oder nicht hämolysierend. Alle
S. uberis-Kulturen produzierten das Enzym beta-D-Glucuronidase, die S. parauberis-Kulturen waren b-D-Glucuronidase-negativ. Bei der
serologischen Gruppenbestimmung zeigten 42 S. uberis-Kulturen und ein S. parauberis-Referenzstamm eine positive Reaktion mit dem
spezifischen Antiserum der Gruppe E, sowie einige Kulturen mit Antiseren der Gruppen P, U und A. Die meisten der S. uberis- und zwei
der S. parauberis-Kulturen konnten keiner Serogruppe zugeordnet werden. Einige der S. uberis-Kulturen agglutinierten mit dem Lektin von
Helix pomatia und zeigten eine CAMP-ähnliche Reaktion mit vollstandiger Hämolyse im Bereich des Staphylokokken-beta-Toxins. Die S.
uberis- und S. parauberis-Kulturen wiesen überwiegend eine hydrophile Oberfläche auf. Dies konnte anhand der Wachstumseigenschaften
in Flüssigmedium und Soft-Agar sowie mittels Salz-Aggregationstests gezeigt werden. Antibiotische Resistenzen waren bei den meisten
Kulturen für Colistin, Sulphamethoxazol/Trimethoprim, Tetracyclin, Clindamycin, Erythromycin und Gentamicin nachweisbar. Alle Kulturen
erwiesen sich als empfindlich gegenüber Penicillin-G.


Die S. uberis- und S. parauberis-Isolate konnten im weiteren mit Hilfe molekularer Methoden charakterisiert werden. Dies erfolgte durch
Amplifizierung des 16S rRNA-Gens durch Polymerasekettenreaktion und anschließendem Restriktionsverdau des Amplikons mit den
Enzymen RsaI und AvaII. Die Identifizierung konnte im weiteren durch Amplifizierung speziesspezifischer Abschnitte der 16s rRNA- und
23S rRNA-Gene sowie der 16S-23S rDNA 'intergenic spacer'-Region bestätigt werden. Die Amplifizierung des cfu-Gens der
CAMP-positiven S. uberis-Kulturen erfolgte unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Primerpaaren. Zusätzlich konnte das Gen für den
potentiellen Virulenzfaktor Streptokinase, das skc/pauA-Gen, bei 128 der insgesamt 132 S. uberis- nicht jedoch bei den S.
parauberis-Kulturen festgestellt werden.


Der Nachweis epidemiologischer Beziehungen ausgewählter S. uberis-Kulturen erfolgte durch Makrorestriktionsanalyse der
chromosomalen DNA der Kulturen und anschließender Pulsfeldgelelektrophorese. Dieses 'DNA-Fingerprinting' ergab keine enge
verwandschaftliche Beziehung zwischen den untersuchten Kulturen. Bei einigen Isolaten aus unterschiedlichen Vierteln einer Kuh, sowie bei
Isolaten von verschiedenen Kühen eines Betriebes waren allerdings auch identische DNA-Muster feststellbar. Die überwiegend nicht
übereinstimmenden DNA-Muster zeigten, dass S. uberis ein Mikroorganismus mit unterschiedlichsten Lebensräumen ist und die
Infektionen in der Regel von einer Vielzahl verschiedener Stämme hervorgerufen werden.


Die in den vorliegenden Untersuchungen benutzten konventionellen und molekularen Methoden erlaubten eine Identifizierung und
weitergehende Charakterisierung von S. uberis und S. parauberis und könnten Aufklärung über die Bedeutung beider Spezies als
Verursacher boviner Mastitiden geben.
Kurzfassung auf Englisch: In the present study 130 S. uberis strains and one S. parauberis strain isolated from bovine milk samples of 59 different farms of various
locations in Hesse, Germany, were comparatively investigated together with four reference strains of both species for cultural, biochemical
and serological properties. The S. uberis and S. parauberis strains generally did not grow on media specific for enterococci, whereas after
cultivation on blood agar both species were alpha -or non-hemolytic. All S. uberis strains produced the enzyme beta-D-glucuronidase, the
S. parauberis were negative for this enzyme. Serogrouping revealed a positive reaction for 42 S. uberis strains and one S. parauberis
reference strain with group E specific antiserum and for some strains with specific antisera of the serological groups P, U and A. However,
most of the S. uberis and two S. parauberis strains were non-groupable. Some of the S. uberis strains agglutinated with the lectin of Helix
pomatia, and showed a CAMP-like reaction of complete hemolysis in the zone of staphylococcal beta-toxin. The S. uberis and S.
parauberis strains displayed a generally hydrophilic surface. This could be demonstrated by determination of growth patterns in fluid media
and soft agar and by salt aggregation tests. Antibiotic resistances could be observed for most of the strains for colistin,
sulphamethoxazole/trimethoprim, tetracycline, clindamycin, erythromycin and gentamicin. All strains were sensitive to penicillin-G.


The S. uberis and S. parauberis isolates were further analyzed by molecular methods. This was performed by amplification of the gene
encoding the S. uberis and S. parauberis 16S rRNA gene by polymerase chain reaction and subsequent digestion of the respective gene
with the restriction enzymes RsaI and AvaII. The species identity could additionally be confirmed by amplifying species-specific parts of the
genes encoding the 16S rRNA, the 23S rRNA and of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region. For CAMP positive S. uberis strains the
gene cfu could be amplified using two different primer pairs. In addition the gene for the potential virulence factor streptokinase, the
skc/pauA gene, could be amplified for 128 of the 132 S. uberis but not for S. parauberis.