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Darstellung apoptotischer und nekrotischer Rattenhepatozyten im Gewebeschnitt nach verschiedenen Fixierungsverfahren und mittels unterschiedlicher Nachweismethoden

Blazey, Birgit Anja


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Veterinär-Pathologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.04.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 03.07.2002
Kurzfassung auf Deutsch: 1. Die Nachweismethoden H&E-Färbung (Standard H&E- und alkoholische H&E-Färbung), Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL-Methode) und die Eosinfluoreszenz wurden zum Apoptosenachweis an
Rattenlebergewebe herangezogen. Hierfür wurde ein Apoptoseinduktionsmodell nach BURSCH et al. (1984; 1985; 1986) verwandt. Das
Gewebe wurde zwischen 1 und 92 Tagen rein in Formaldehyd, einen Tag in Formaldehyd fixiert und anschließend für die angegebene Zeit
in Alkohol überführt oder in Carnoy fixiert. Zur Spezifitätskontrolle wurde ermittelt, inwieweit nekrotische Zellen oder andere unerwünschte
Strukturen gleichfalls erfasst wurden.


2. Standard H&E- und alkoholische H&E-Färbung:


Um die geringsten Schwankungen der Werte auch bei archiviertem Nassmaterial zu erhalten, ist die Auswertung von Studien im
Standard-Lichtmikroskop an Standard-H&E-Schnitten nach einer reinen Fixierung in Formaldehyd zu empfehlen. Sowohl bei der
Routinefixierung (1 Tag) als auch beim Einsatz an Archivmaterial wurden hierbei basierend auf morphologischen Kriterien die geringsten
Schwankungen der Apoptose-Indizes erhalten. Bei den einen Tag Formaldehyd-fixierten und anschließend in Alkohol verbrachten Organen
erwiesen sich die Daten als unzuverlässiger als nach reiner Formaldehyd-Fixierung. Die Carnoy-Fixierung in Kombination mit der
0,4%igen alkoholischen H&E-Färbung hat bei standard-lichtmikroskopischer Auswertung das Ziel einer schnellen und si-cheren
Auswertung nicht erreicht.


3. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL)


Im Vergleich zu der Standardmethode (Standard-H&E-Färbung) wurden mit der TUNEL-Methode höhere Apoptose-Indizes erhalten,
allerdings mit einer breiteren Streuung der Daten. Mit einer Reduktion der Markierung bei längerer Fixierung und einer Reduktion der
Färbeintensität, besteht beim Einsatz an Archivmaterial ein größerer Unsicherheitsfaktor als bei der Standard-H&E-Färbung. Es traten
sehr starke nicht-hepatozelluläre TUNEL-positive Signale auf und nekrotische Zellen wurden zu 22%-40% ebenfalls markiert. Die zusätzlich
notwendige morphologische Kontrolle ließ somit keine unkritische Auswertung der positiven Signale zu und schränkt den Einsatz eines
rechnergestützten Bildanalysegerätes erheblich ein. Wurden die Lebergewebeproben nach einem Tag in Formaldehyd-Fixierung
anschließend in Alkohol aufbewahrt, wurden die höchsten AI erhalten, allerdings mit dem Nachteil breiterer 95%iger Vertrauensbereiche
der Mittelwerte als bei reiner Formaldehyd-Fixierung und somit unzuverlässigerer Daten.


4. Eosinfluoreszenz

Bei der Fluoreszenz-Methode wiesen die Quotienten der Anstiegsfaktoren beider Dosisgruppen (der Anstiegsfaktor entspricht dem
Anstieg des AI von der Kontrolle auf den AI der jeweiligen Dosisgruppe) gegenüber der TUNEL-Methode weniger breite Streuungen auf
und die AI entsprachen nach eintägiger Fixierung in etwa den Standard-H&E-Daten. Trotzdem kann der Einsatz der
Fluoreszenzmikroskopie an Archivmaterial nicht befürwortet werden, da bereits nach siebentägiger Fixierung die Apoptose-Indizes
erheblich reduziert waren und nach vierwöchiger Fixierung die AI weiter reduziert wurden. Das Auffinden der AB nach einem Tag Fixierung
wird anhand der Fluoreszenzmikroskopie allerdings erheblich erleichtert (STINCHCOMBE, 1996). Nekrotische Zellen wiesen ebenfalls
eine Fluoreszenz auf. Ebenso wurden fluoreszierende Strukturen (FS) ermittelt, die nicht der Apoptose zugeordnet werden konnten. Da
eine morphologische Kontrolle aufgrund der schwachen Färbung (alkoholische H&E-Färbung) kaum möglich war, wird insbesondere der
Einsatz der Fluoreszenz-Methode an Material, das länger als sieben Tage fixiert wurde, nicht empfohlen.

Kurzfassung auf Englisch: 1. Detection of apoptotic cells and bodies in rat liver was determined by hematoxylin and eosin (H&E)-staining (standard and alcoholic
H&E), terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL method), and eosin fluorescence. We used the
apoptotic induction model of BURSCH et al. (1984; 1985; 1986). The tissue samples were fixed over various time periods between 1 and
92 days. Three fixation methods were used: formaldehyde only, one day formaldehyde fixation followed by a 70% ethanol fixation, or fixation
in carnoy solution. Necrotic cells or other positive structures which could be mistaken for apoptotic hepatocytes were counted as a control
for specifity.


2. Standard H&E- and alcoholic H&E-staining


To avoid individual changes in the results, the use of standard light microscopy in combination with standard H&E-staining after
formaldehyde fixation only is recommended. Based on morphological characteristics, both, routine (one day) and long term (several weeks)
fixation with 4% formaldehyde achieved the best apoptotic indices with the lowest variety. The data obtained after the fixation method with
formaldehyde followed by ethanol are less reliable than after use of pure formaldehyde fixation. Carnoy fixation followed by alcoholic H&E
staining showed only very weak staining and was therefore not useful for rapid and specific determination of apoptotic rates by standard
light microscopy.


3. Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) Compared to AI obtained by H&E staining and
standard light microscopy the AI measured with the TUNEL method were higher but also had bigger variations. With reduced amount of
TUNEL-positive apoptotic cells and bodies accompanied by reduced intensity of the staining the use of TUNEL staining for material fixed
over longer time periods seems to result in less reliable data. Non-hepatocytes and 22%-40% of the necrotic cells were TUNEL positive
and showed intense staining. In conclusion, the TUNEL method in combination with an image processing and analysis system is only useful
in combination with morphologic control of positive signals. The highest AI were determined with fixation of the material in formaldehyde
followed by ethanol. The 95% confidence interval, however, was broader than after formaldehyde fixation only, thus the data less reliable.


4. Eosin fluorescence


Using the eosin fluorescence technique for estimating apoptotic indices yielded AI quotients (AI treated animals divided by AI of untreated
animals) with lower standard deviations compared to the AI quotients calculated from the data obtained via TUNEL staining. After one day
of fixation the data obtained via the eosin fluorescence was similar to the data determined by using the H&E staining. However, our study
showed that with the eosin fluorescence a reduction of AI is already happening after a fixation period of 7 days. After longer tissue fixation
period the AI was reduced in higher values. Easy and fast recognition of apoptotic bodies with the fluorescence method after a short time
fixation is still an advantage of this method (STINCHCOMBE, 1996). Necrotic cells showed fluorescence, too. Additionally, we found
fluorescing structures (FS) in the tissue that could not be related to an apoptotic event. A morphologic control with H&E is nearly impossible
because of the very weak tissue staining due to the alcoholic H&E staining method. In conclusion it leads to the recommendation to use the
fluorescence technique only in tissue fixed for less than 7 days.