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Vergleichende Untersuchungen zum Hämozytenbild von Larve und Puppe des Tabakschwärmers Manduca sexta L.

Beetz, Susann


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Allgemeine und Spezielle Zoologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 27.06.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel meiner Dissertationsarbeit waren 'Vergleichende Untersuchungen zum Hämozytenbild von Larve und Puppe des Tabakschwärmers
Manduca sexta'. Dabei wurden insbesondere die Blutzellen während der ersten Tagen des letzten Larvenstadiums und der ersten Tage
des Puppenstadiums miteinander verglichen. Zwischen diesen beiden Zeitpunkten beginnt die Metamorphose, was ein
"Umprogrammieren" vieler Zellen und Gewebe im Insektenorganismus bedeutet.

Als die Aufgabenstellung der Dissertation formuliert wurde, war über die Hämatopoiese der Insekten und speziell der Lepidoptera wenig
bekannt. Die Nomenklatur der Hämozyten war nicht einheitlich. Daher war die bis dahin veröffentlichte Literatur nur schwer vergleichbar und
teilweise sogar widersprüchlich. Jüngste Forschungsergebnisse auf dem Gebiet der zellulären Immunität bei Insekten und deutliche
Hinweise auf Zusammenhänge zwischen immunologischen und entwicklungsbiologischen Prozessen rückten die Hämozyten erneut in den
Mittelpunkt entwicklungsbiologischer Forschung.

Zunächst wurde die Morphologie der Hämozyten der Larven und Puppen vergleichend licht- und elektronenmikroskopisch untersucht. In
Larven wurden Plasmatozyten, granuläre Zellen, sphärule Zellen und Oenozytoide unterschieden, in Puppen dagegen nur Plasmatozyten
und granuläre Zellen. Die pupalen Hämozyten unterschieden sich zudem in ihren Eigenschaften von ihren larvalen Gegenstücken. Auch die
Zellzahlen in der Hämolymphe änderten sich. Während Plasmatozyten und granuläre Zellen zu Beginn des letzten Larvenstadiums ähnlich
häufig auftraten, überwogen Plasmatozyten in der Hämolymphe der Puppen.

Das Kernstück meiner Arbeit war die Charakterisierung der Hämozyten durch monoklonale Antikörper und Lektine. Dabei wurden alle zur
Verfügung stehenden 214 monoklonalen Antikörper aus der Arbeit von WILLOTT et al. (1994) und deren Subklone genutzt. 28 monoklonale
Antikörper zeigten Markierungsunterschiede im Vergleich zwischen Larven- und Puppenhämozyten. Diese Muster wurden zu 10
Kategorien zusammengefasst. Daneben wurden 14 Lektine getestet, zwei davon banden unterschiedlich an larvale und pupale Hämozyten.

Im folgenden wurden die korrespondierenden Antigene / Liganden biochemisch charakterisiert und die Hämozytenspezifität dieser
Antikörper / Lektine bzw. Kreuzreaktivität gegen andere Gewebe incl. des Hämolymphplasmas bestimmt.

Ein Antikörper und ein Lektin mit jeweils eindeutiger Hämozytenspezifität und einer distinkten Bande in der Western-Blot-Analyse der
Hämozytenlysate wurden ausgewählt, um den entsprechenden Liganden zu isolieren und zu identifizieren. Beides waren integrale
Membranproteine, die Proteinreinigungsversuche erwiesen sich daher als schwierig. Ähnliche Untersuchungen bei anderen Insektenarten
lassen vermuten, daß es sich bei dem Liganden des Lektins um ein Mucin handelt. Der Anitkörper bindet vermutlich an ein Integrin.

Daneben wurden weitere Methoden angewendet, um Unterschiede zwischen larvalen und pupalen Hämozyten zu finden. Besonders die
Auftrennung der Hämozytenproteine durch zweidimensionale Elektrophorese ist eine vielversprechende Methode, um unterschiedlich
exprimierte Proteine in Larven- und Puppenhämozyten zu identifizieren. Diese Methode konnte während der Arbeit so weit optimiert
werden, daß zumindest im pH-Bereich 4-7 eine auswertbare Auftrennung der Proteine gelang.

Parallel dazu wurde die Percolldichtegradientenzentrifugation angewendet, um Gesamthämozyten aus Larven und Puppen in einzelne
Fraktionen, d.h. in die unterschiedlichen Hämozytentypen zu trennen. Pupale Plasmatozyten und granuläre Zellen konnten eindeutig
getrennt werden. Bei larvalen Hämozyten gelang zumindest eine Anreicherung bestimmter Typen. Die Kombination aus
Percolldichtegrandientenzentrifugation und 2D-Elektrophorese ist vielversprechend, um spezifisch exprimierte Proteine der einzelnen
Zelltypen zu identifizieren. Erste Versuche dazu liegen vor.

Für ergänzende Untersuchungen wurde die in vitro-Primärkultivierung von Hämozyten etabliert. Diese Methode wurde u.a. dazu benutzt, um
den direkten Einfluß von b-Ecdyson auf die Hämozyten zu untersuchen.

Im Verlauf der Arbeit wurden verschiedene Hypothesen bezüglich Hämatopoiese sowie Differenzierung und Funktion der Blutzellen
entwickelt und getestet. In diese Untersuchungen wurde auch das hämatopoietische Organ einbezogen. Eine der wesentlichen
Beobachtungen dabei war, daß Plasmatozyten vermutlich aus Vorläuferzellen aus dem hämatopoietischen Organ entstehen. Unter den frei
flottierenden waren die mitotisch aktiven Zellen zumeist granuläre Zellen.