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Identifizierung neuer Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Methylerythritol-4-phosphat-Stoffwechselweges zur Isoprenoidbiosynthese

Altincicek, Boran


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Biochemisches Institut der Uniklinik
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 04.06.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Der Mevalonat (MVA)-unabhängige Methylerythritol-4-phosphat (MEP)-Stoffwechselweg zur Biosynthese von Isoprenoiden wurde erst vor
wenigen Jahren in Bakterien und in den pflanzlichen Plastiden identifiziert. Da dieser für viele Organismen essentielle Stoffwechselweg im
Menschen nicht vorkommt, stellen die beteiligten Enzyme geeignete Zielstrukturen für die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe dar.


Zu Beginn dieser Arbeit waren nur zwei Enzyme, die 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (DOXP)-Synthase (DXS) und
DOXP-Reduktoisomerase (DXR) bekannt, die die ersten beiden Reaktionsschritte des MEP-Stoffwechselweges katalysieren. Mit Hilfe
von bioinformatischen Ansätzen konnten verschiedene Gene identifiziert werden, die möglicherweise für noch unbekannte Enzyme des
MEP-Stoffwechselweges kodieren. Um die Beteiligung dieser Gene an dem MEP-Stoffwechselweg zu beweisen, wurde ein genetischer
Ansatz gewählt. Hierzu wurden zuerst genetisch veränderte Escherichia coli-Bakterien generiert, die in der Lage sind,
Isopentenylpyrophosphat aus exogenem Mevalonat zu synthetisieren. Dazu wurde ein künstliches Operon konstruiert, das den E.
coli-Bakterien die Expression der Hefe-Gene der MVA-Kinase (MVK), Phospho-MVA-Kinase (PMK) und der
MVA-pyrophosphat-Decarboxylase (MPD) erlaubt. In diesen Bakterien konnten im MEP-Stoffwechselweg involvierte Gene deletiert
werden. Dabei wurden die Gene gcpE und lytB als neue Gene des MEP-Stoffwechselweges in E. coli identifiziert. Zellen mit Deletionen
dieser Gene konnten nur überleben, wenn das Medium mit Mevalonat supplementiert worden war oder die Zellen eine entsprechende
episomale Kopie des jeweiligen Genes enthielten.


Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß ein bisher unbekanntes Intermediat des MEP-Stoffwechselweges zur Aktivierung von
polyklonalen Vg9Vd2 T-Zellen des menschlichen Immunsystems verantwortlich ist. Deshalb wurden die generierten Deletionsmutanten in
gd T-Zellaktivierungs-Experimente eingesetzt. Hierbei stellte sich heraus, daß gcpE-Gendeletionsmutanten ihr gd
T-Zellaktivierungspotential fast vollständig verloren hatten, während lytB-Gendeletionsmutanten ein über 100-fach höheres Potential als der
Wildtyp besaßen. Als gd T-Zellaktivator konnte eine Substanz isoliert werden, deren Struktur als
(E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP) aufgeklärt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, daß HMBPP ein neues
Intermediat des MEP-Stoffwechselweges ist und das Produkt von GcpE und das Substrat von LytB darstellt.