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Identifizierung von Interaktionspartnern des response Regulators RegA aus Rhodobacter capsulatus

Gregor, Jutta


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Mikro- und Molekularbiologie, Fachbereich Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.04.2002
Erstellungsjahr: 2002
Publikationsdatum: 23.05.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Rhodobacter capsulatus ist ein fakultativ phototrophes Purpurbakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Licht in
der Lage ist, eine anoxygene Photosynthese zu betreiben. Fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung unter einen Schwellenwert, so
beginnt Rhodobacter mit der Herstellung der Photosynthesekomplexe. In der sauerstoff-regulierten Synthese des Photosyntheseapparates
spielt das RegB/RegA-Zweikomponentensystem eine wichtige Rolle. Die membrangebundene Sensorkinase RegB autophosphoryliert
wenn der Sauerstoffgehalt der Umgebung fällt und überträgt eine Phosphatgruppe auf den response Regulator RegA. Phosphoryliertes
RegA reguliert dann die Transkription von zahlreichen Zielgenen. Zu diesen Zielgenen gehören, neben den Genen, die zur Herstellung des
Photosyntheseapparates benötigt werden, auch solche Gene, die für Stickstoff-Fixierung, Kohlendioxid-Fixierung und eine Reihe weiterer
Prozesse, notwendig sind. RegA ist damit ein globaler Transkriptionsregulator, der die Transkription zahlreicher verschiedener Gene bei
niedrigem Sauerstoffpartialdruck aktiviert bzw. in einigen Fällen auch reprimiert. Neben dem RegB/RegA Zweikomponentensystem sind
eine Vielzahl weiterer Faktoren an der Regulation der einzelnen Gene beteiligt. Daher ist es denkbar, dass der response Regulator RegA
eine Wechselwirkung mit anderen Proteinen eingeht, um eine spezifische Regulation der einzelnen Prozesse zu gewährleisten. Für die
Suche nach solchen interagierenden Proteinen wurde in dieser Arbeit das Hefe 2-Hybridsystem eingesetzt. Mit dieser Methode konnte der
response Regulator NtrX als Interaktionspartner von RegA identifiziert werden. Das zugehörige Zweikomponentensystem bestehend aus
der Sensorkinase NtrY und dem response Regulator NtrX ist in Azorhizobium caulinodans an der Regulation von
Stickstoff-Fixierungsgenen beteiligt. Zur transkriptionellen Regulation dient in A. caulinodans der nifA-Promotor, der in R. capsulatus unter
anderem unter der Kontrolle des RegB/RegA-Zweikomponentensystems steht. Die Interaktion von RegA und NtrX konnte anschließend mit
einem GST-pulldown assay verifiziert werden, bei dem eine Kopräzipitation beider Proteine in vitro festgestellt werden konnte.
NtrX-Deletionsmutanten von R. capsulatus zeigten deutlich veränderte Zusammensetzungen innerhalb der Photosynthesekomplexe, die
abhängig vom Ammoniumgehalt des verwendeten Mediums waren. Weiterhin wiesen die NtrX-Mutanten höhere Mengen an
Photosynthesekomplexen auf, verglichen mit dem Wildtyp. Bei einer Überexpression von NtrX in R. capsulatus dagegen ist die Menge an
Photosynthesekomplexen um 30 % niedriger als im Wildtypstamm. NtrX könnte also ein negativer Regulator der
Photosynthesegenexpression sein. Eine NtrX-Variante, bei der die putative Phosphorylierungsstelle D52 gegen Glutamat ausgetauscht
wurde, zeigte in Gelretardationsexperimenten eine Bindung an den Promotor des Photosynthese-Operons puf (kodiert u. a. Proteine für
Antennenkomplex I und Reaktionszentrum). Diese DNA-Bindung von NtrX deutet darauf hin, dass das Protein durch direkte
Wechselwirkung mit der Ziel-DNA einen Einfluss auf die Menge der Photosynthesekomplexe nehmen kann.

Kurzfassung auf Englisch: Rhodobacter capsulatus is a facultatively phototrophic purple bacterium. It is able to perform anoxygenic photosynthesis under anaerobic
conditions in the presence of light. The formation of pigment protein complexes in facultatively photosynthetic bacteria of the genus
Rhodobacter is only induced when the oxygen tension drops below a threshold value. In R. capsulatus the sensor kinase RegB
autophosphorylates in a redox-dependent manner. It then transfers the phosphatidyl residue to the response regulator RegA, a DNA
binding protein which activates transcription of a number of genes for pigment binding proteins and for pigment syntheses. Among the
genes activated by RegA at low oxygen tension are the genes of the puf and puc operons. The puf operon comprises genes encoding
pigment binding proteins of the light harvesting (LH) I complex and of the reaction center complex, and regulatory proteins. Genes required
for the formation of the LH II complex are part of the puc operon. The RegB/RegA two component system is also involved in
redox-dependent regulation of genes for nitrogen fixation, Calvin cycle enzymes, hydrogenase, and for enzymes of the respiratory chain. In
order to test whether the coregulation of different redox-controlled regulons also involves a direct interaction of regulatory proteins the yeast
two-hybrid system was applied to search for proteins interacting with the response regulator RegA. NtrX, the response regulator of the
NtrY/NtrX two component system was identified as interaction partner of RegA. In Azorhizobium caulinodans the NtrY/NtrX two component
system is involved in the regulation of nitrogen fixation genes. The interaction of RegA and NtrX was confirmed by GST pulldown
experiments. To learn more about the role of NtrX in R. capsulatus, Rhodobacter strains were constructed, which harbor a knock-out of the
chromosomal ntrX gene. These mutants showed a different composition of their photosynthetic components compared to the wild type. The
change in composition was dependent on the amount of ammonium added to the medium. Additionally, all NtrX mutants showed more
photosynthetic complexes than the wild type strain. When NtrX was overexpressed in R. capsulatus the cells contained lower amounts of
photosynthetic complexes than wild type cells. NtrX seems to be a negative regulator of the photosynthetic complexes in R. capsualtus.
Since NtrX has a typical helix-turn-helix motif for DNA-binding, gel retardation assays should show, whether NtrX can directly interact with
the promoter regions of the photosynthesis operons puf and puc. An interaction of NtrX with the puf promoter region was only detectable,
when a NtrX variant was used in the gel retardation assay. This NtrX variant harbored an amino acid exchange at the putuative
phosphorylation site of the protein so that the conserved aspartate at position 52 was changed to glutamate. Theses results lead to the
suggestion that the NtrX mediated negative regualtion of photosynthetic complexes in R. capsulatus is due to a direct interaction of NtrX
with the puf promoter region.