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Neue Fluoreszenzmethoden zur strukturellen und funktionellen Genomanalyse (Fish and Chips)

Hardt, Tanja


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik, Berlin-Dahlem
Fachgebiet: Physik
DDC-Sachgruppe: Physik
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 08.04.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Die Fluoreszenz- in situ -Hybridisierung (FISH) bietet eine Vielzahl hochentwickelter Untersuchungsmethoden zur Analyse chromosomaler
Veränderungen des Genoms. Dazu gehören u. a. die 'Vergleichende Genomische Hybridisierung' (Comparative Genomic Hybridisation,
CGH) und die Vielfarben-FISH mit den zwei Methoden M-FISH (Multicolor-FISH) und SKY (Spectral Karyotyping, Spektrale
Karyotypisierung).


Mit 24-Farben-FISH lassen sich alle menschlichen Chromosomen durch kombinatorische Markierung mit nur fünf Fluoreszenfarben
unterscheiden. Dadurch wird eine eine spezifische Färbung jedes der 24 menschlichen Chromosomen in einem
Hybridisierungsexperiment möglich. Diese Methode eignet sich insbesondere zur Untersuchung von Translokationen, da sich die
ausgetauschten Segmente zweier Chromosomen durch ihre unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung leicht aufdecken lassen.


Die CGH deckt hingegen numerische Unterschiede, Deletionen und Amplifikationen einzelner Chromosomen oder
Chromosomenabschnitte, auf. Durch vergleichende Hybridisierung verschiedenfarbig markierter Genome auf eine Kontrollmetaphase
können genomische Imbalancen zwischen zwei Genomen detektiert werden. Deletionen und Amplifikationen werden durch Unter- bzw.
Überrepräsentation einer Hybridisierungssonde auf den betreffenden Chromosomenregionen sichtbar. Ein limitierender Faktor der CGH
ist die Notwendigkeit, komplexe Strukturen auszuwerten, da die Hybridisierung auf Chromosomenpräparaten stattfindet. Mit der
Entwicklung der DNS-Chip-Technologie kann eine Vielzahl von DNS-Sonden auf kleinstem Raum aufgebracht werden. Diese Technik
ermöglicht es, das Auflösungsvermögen der chromosomalen CGH um ein Vielfaches zu erhöhen. Der Chip ersetzt dabei die
Chromosomenpräparate. Mit dieser Methode können ganze Genome in einem Hybridisierungsexperiment gleichzeitig auf Gewinn oder
Verlust definierter DNS-Sequenzen (Sonden) untersucht werden. Die Hybridisierungsunterschiede werden statt auf den Chromosomen auf
den 'gespotteten' DNS-Sequenzen festgestellt.


In dieser Arbeit wurden mehrere Methoden zur Detektion von strukturellen und numerischen Aberrationen etabliert. Die Möglichkeiten und
Limitationen von SKY zur 24-Farben-FISH- Analyse wurde zunächst am Beispiel von Translokationsfällen demonstriert. Dabei wurde u. a.
ein Patient mit Moebiussyndrom untersucht, der eine äußerst komplexe Translokation zwischen vier Chromosomen aufwies.


Eine neuartige Anwendung von SKY war die Untersuchung bestrahlter menschlicher Zellen zum Nachweis von Chromosomenaberrationen
als Folge einer strahleninduzierten genetischen Instabilität. Strukturelle Chromosomenveränderungen sind seit langem
Untersuchungsobjekt der biologischen Strahlenforschung. Mit der Methode der Spektralen Karyotypisierung (SKY) eröffnete sich die
Möglichkeit, alle Chromosomen einer Zelle in einem Experiment auf Translokationen zu untersuchen und genomische Instabilität in
bestrahlten Zellkulturen festzustellen. Strahleninduzierte genetische Instabilität gehört zu den aktuellsten und umstrittensten Themen der
modernen Strahlenbiologie. Der experimentelle Ablauf und die Anwendung der SKY ermöglichten es, alle stabilen Translokationen zu
registrieren und unmittelbar nach Bestrahlung ausgelöste Aberrationen von denen zu unterscheiden, die durch Instabilität hervorgerufen
wurden. Bei der Untersuchung von P3 Zellen ca. 20 Tage nach Bestrahlung konnten nur in 17% der analysierten Zellen eine Instabilität
aufgedeckt werden. Diese Rate ist nicht signifikant höher als die Häufigkeit von spontanen Aberrationen in unbestrahlten P3 Kontrollzellen
(13%).


Als Beispiel zur Erhöhung des Auflösungsvermögen der Vielfarben-FISH wurde eine Fluoreszenzbandierung verschiedener
Fluoreszenzfarben individueller Chromosomen durchgeführt. Am Beispiel der Chromosomen 2 und X wurde die Barkodierung mit YACs
demonstriert. Während die 24-Farben-FISH ausschließlich Austauschaberrationen zwischen verschiedenen Chromosomen entdeckt,
ermöglicht die Barkodierung auch die Auflösung von intrachromosomalen Aberrationen und Bruchpunktkartierung.


Zur Untersuchung chromosomaler Imbalancen wurde in dieser Arbeit die Etablierung einer Matrix-CGH vorgestellt. Diese Methode bedient
sich der Chiptechnologie, um Sonden auf kleinstem Raum, auf einem Chip, aufzubringen. Zur Untersuchung genetischer Unterschiede
(Imbalancen) zwischen zwei Genomen wurde in Analogie zur chromosomalen CGH eine Matrix-CGH etabliert. Dazu wurden
Inter--Alu-PCR-Produkte zytogenetisch und genetisch verankerter YACs als Sonden auf Glasobjektträgern (Chips) gespottet und
Inter-Alu-PCR-Produkte genomischer DNS als Targets auf den Chip hybridisiert. Anhand von Hybridisierungsunterschieden auf
X-chromosomalen und autosomalen Sonden bei komparativer Hybridisierung von multiplen X-Zellinien mit weiblicher (46,XX) und
männlicher (46,XY) genomischer DNS wurde die Matrix-CGH soweit entwickelt, daß Dosisverhältnisse von 2:1 detektiert werden konnten.
Damit sind die Voraussetzungen für die Verwendung von CGH-Chips für den Nachweis von Deletionen und Duplikationen in der
Chromosomendiagnostik geschaffen. Man nimmt an, daß die Matrix-CGH in Zukunft einen großen Teil der bisher üblichen
Chromosomenbänderungsanalysen ersetzen wird.


Sowohl das Auflösungsvermögen der Matrix-CGH als auch der FISH-Barkodierung könnte durch die Wahl kleinerer DNS-Sonden erhöht
werden. Bei der Matrix-CGH handelt es sich um eine sehr 'junge' Methode, die durch Optimierung der Hybridisierungsbedingungen und
Sondenauswahl noch erheblich verbessert werden kann. Im Gegensatz zur chromosomalen CGH ist eine Automatisierung und
Miniaturisierung der Technik denkbar.


Als weitere Neuentwicklung zur Unterscheidung zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen wird eine Kombination
chromosomaler CGH und der SKY vorgestellt. Dabei wird eine herkömmliche CGH auf Metaphasechromosomen mit dem SKY-System
ausgewertet. Dadurch eröffnen sich neue technische Möglichkeiten zum Nachweis von genomischen Imprintingdefekten.


Die Kombination von SKY und CGH (auf Metaphasechromosomen) ermöglichte die Unterscheidung zwischen väterlichen und mütterlichen
Chromosomen von MMU x MSP Maushybriden. Mit der dargestellten Methode konnten bis zu 70% der Chromosomen durch
Hybridisierungunterschiede in den euchromatischen Chromosomenbereichen ihrer elterlichen Herkunft nach zugeordnet werden. Die
Sensitivität der entwickelten Methode muß um den Faktor 10 gesteigert werden, um eine Diagnostik von UPDs und Imprintingkrankheiten
beim Menschen zu ermöglichen. Die Differenzierung zwischen väterlichen und mütterlichen Chromosomen ist eine der größten
Herausforderungen und Ziele in der modernen Chromosomenforschung.


Durch das Humangenomprojekt steigt die Anzahl der zur Verfügung stehenden DNS-Sonden zur Analyse von Chromosomenaberrationen
ständig an. Damit vervielfältigen sich die Anwendungsmöglichkeiten für moderne molekularzytogenetische Methoden (FISH und Chips).