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Ontogenetische Veränderung des Plasmaleptinspiegels und seine Regulation bei 10 Tage alten Ratten

Hufnagel, Carmen


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für physiologische und klinische ForschungW.G. Kerckhoff-Institut Bad Nauheim, eingereicht über das Institut für Veterinär-Physiologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 22.02.2002
Kurzfassung auf Deutsch: Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren die entwicklungsbedingten Veränderungen des Plasmaleptinspiegels bei Ratten im
Säuglingsalter sowie seine physiologische Regulation unter besonderer Berücksichtigung des als 'fa'-Mutation bezeichneten
Leptinrezeptor-Gendefekts. Als Grundlage für die Analyse der durch den Gendefekt bedingten Abweichungen von der Norm wurden
methodische Voruntersuchungen an gesunden, sog. Wildtyp-Tieren im Zeitraum zwischen der 1. und 5. Lebenswoche durchgeführt, wobei
der Zeitgang des Plasmaleptinspiegels, seine Beziehung zum Körperfettgehalt und speziell sein Verhalten am 10. Lebenstag ermittelt
wurde. Auf dieser Grundlage wurde der Einfluß der Gendosis, das heißt, die Auswirkungen des homozygoten (fa/fa) oder heterozygoten
(+/fa) Auftretens des Rezeptor-Gendefekts bzw. seine Abwesenheit beim Wildtyp (+/+) analysiert, und zwar zu zwei ontogenetisch
definierten Zeitpunkten. Zum einen wurde der Plasmaleptinspiegel im perinatalen Zeitraum auf Abhängigkeiten von der Gendosis
untersucht. Zum anderen erfolgte eine eingehende Analyse der Interaktion der Gendosis mit der physiologischen Kontrolle des
Plasmaleptinspiegels und mehrerer auf ihn einwirkender Einflußgrößen am 10. Lebenstag, weil aufgrund früherer Befunde zu dieser Zeit
mit dem Wirksamwerden der Gendosis als Einflußgröße zu rechnen ist. In diesen Untersuchungen wurden nach vorangehender
mehrtägiger Manipulation der Energiezufuhr und der äußeren thermischen Belastung alle für die Energiebilanz relevanten Parameter
gemessen, sowie die Größe der Leptin-mRNA-Konzentration im Braunen (BAT) und Weißen (WAT) Fettgewebe als den wesentlichen
Bildungsorten des Leptins erfaßt. Bei der Analyse der Meßdaten diente die Metabolische Rate (MR) als Surrogatvariable für die
experimentell durch Noradrenalin-Infusion manipulierte sympatho-adrenerge Aktivitität (SAA), die Nettoenergiezufuhr, das heißt, die
Differenz zwischen den mit der Milch zugeführten und den im Stoffwechsel verbrauchten Energiemengen, als Surrogatvariable für die
Gesamtheit der zellulären Energieströme und der Gesamtkörperfettgehalt als Surrogatvariable für den Lipidgehalt der Adipozyten. Die
Auswertung der Rohdaten erfolgte mittels zweifaktorieller Varianzanalyse und einfacher sowie multipler Regressionsanalysen und führte zu
den folgenden Ergebnissen.


1. Bereits kurz nach der Geburt - noch vor Beginn der Triglyzeridspeicherung - aber nicht pränatal, kann als früheste durch den
Leptinrezeptordefekt verursachte Störung ein deutlicher Gendosis-Effekt auf den Plasmaleptinspiegel nachgewiesen werden.


2. Der Plasmaleptinspiegel nimmt bei Wildtyp-Tieren während der ersten beiden Lebenswochen deutlich und danach langsamer ab. Dabei
weist der Plasmaleptinspiegel in den ersten beiden Lebenswochen stärkere Schwankungen auf als in der 3.-5. Lebenswoche, jedoch
kommt es nicht zu sprunghaften Veränderungen, die den Aussagewert der im Alter von 10 Tagen durchgeführten speziellen
Untersuchungen hätten beeinträchtigen können.


3. Eine künstliche Aufzucht unter moderater Kältebelastung eliminiert nicht die hohen Plasmaleptinspiegel der fa/fa Tiere gegenüber ihren
+/fa und +/+ Wurfgeschwistern, die sich bei normaler Aufzucht unter Kältebelastung zeigen.


4. Bereits eine kurzfristige künstliche Aufzucht über 2 Tage unter thermoneutralen Bedingungen gleicht noch vor dem Auftreten von
Änderungen des Körperfettgehaltes den Energieverbrauch von +/fa und fa/fa Tieren auf minimalem Niveau einander an und eliminiert
Faktoren, die für die überhöhten Plasmaleptinspiegel von fa/fa Tieren unter Kältebelastung verantwortlich sind.


5. Eine Dauerbehandlung mit Noradrenalin über 6 Tage führt schon bei niedriger Dosis zu einer Angleichung der Plasmaleptinspiegel von
fa/fa und +/fa Tieren, ohne daß damit eine Reduzierung des Gesamtkörperfettgehaltes verbunden sein muß.


6. Es zeigte sich sowohl bei normaler wie künstlicher Aufzucht für Plasmaleptinspiegel <10 ng/ml ein starker Einfluß der
Leptin-mRNA-Konzentration im BAT auf den Plasmaleptinspiegel, die 60% seiner Variabilität erklärt, während der Einfluß der
Leptin-mRNA-Konzentration im WAT weniger als 10% betrug. Bei dieser Analyse zeigte sich zudem auch ein schwacher Genotyp-Einfluß.


7. Bei Plasmaleptinspiegeln >10 ng/ml, wie sie vor allem bei fa/fa Tieren unter Kältebelastung beobachtet wurden, sind Effekte des
Leptinrezeptordefekts wirksam, die weder mit der Leptin-mRNA-Konzentration im BAT und WAT, noch mit der SAA in Zusammenhang
gebracht werden können.


8. Werden für Plasmaleptinspiegel <10 ng/ml die Einflußvariablen ohne Berücksichtigung der Leptin-mRNA-Konzentration im BAT und
WAT als intervenierenden Variablen analysiert, ergibt sich ein positiver Einfluß des Körperfettgehaltes, der mehr als 50% der Variabilität
erklärt, und ein negativer Einfluß der SAA, der weitere 10% der Variabilität erklären kann, jedoch kein Einfluß der Gendosis.


9. Die Leptin-mRNA-Konzentration im BAT ist eng mit der SAA korreliert, sie erklärt 90% ihrer Variabilität. Dagegen konnten die
untersuchten Variablen insgesamt nur knapp 50% der Variabilität der Leptin-mRNA-Konzentration im WAT erklären, wobei die
Nettoenergiezufuhr die dominierende Einflußgröße darstellte und der Körperfettgehalt, sowie die SAA nur eine geringe Rolle spielten.
Dabei muß berücksichtigt werden, daß die Surrogatvariable Nettoenergiezufuhr wesentlich weniger eng mit den Energieströmen im WAT
assoziiert ist, als die Surrogatvariable MR mit der sympathisch kontrollierten Aktivierung des BAT.


Diese Ergebnisse lassen sich zusammenfassend wie folgt interpretieren.


(a) Ein von der Fettspeicherung unabhängiger Einfluß des 'fa'-Gendefekts auf die Leptinsekretion ist bereits unmittelbar nach der Geburt
nachweisbar.


(b) Im Alter von 10 Tagen ist eine autokrine, durch den Leptinrezeptor an der Fettzelle selbst vermittelte Regelung der
Leptin-Gen-Expression unter dem Einfluß des Plasmaleptinspiegels selbst noch nicht wirksam. Infolgedesssen wird die bei normal
aufgezogenen Tieren im Alter von 10 Tagen nachweisbare negative Rückkopplung des Leptins auf seine Expression im BAT
wahrscheinlich durch zentralnervöse Leptinrezeptoren vermittelt, und zwar über deren Einfluß auf die sympathische Aktivität.
Rückkopplungseffekte auf die Expression des Leptin-Gens im WAT resultieren wahrscheinlich, aber nicht ausschließlich aus
Veränderungen der Energieströme.


(c) Außer den in der vorliegenden Untersuchung identifizierten Rückkopplungswirkungen des Leptins auf seine Expression weisen einige
Befunde auf weitere unbekannte Regelungsfaktoren hin, die sowohl bei normaler Aufzucht als auch bei künstlicher Aufzucht unter
Kältebelastung wirksam sind, jedoch durch die Herstellung thermoneutraler Bedingungen eliminiert werden und deren Störung zur
Hyperleptinämie der +/fa und fa/fa Tiere beiträgt.

Kurzfassung auf Englisch: The investigations of this study were concerned with the ontogenetic changes in plasma concentration of the hormone leptin in suckling-age
rats and its physiological regulations with special reference to the so-called 'fa' gene defect of the leptin receptor. Analytical studies
proceeded from the evaluation of the time course of plasma leptin and its relationship with body fat content during the developmental period
between the first and fifth week of life, concentrating in particular on the phase around the 10th day of life. Based on these studies the
influence of the 'gene dose', i.e., the homozygous (fa/fa), and heterozygous (+/fa) presence of the gene defect or its total absence in the
wildtype animal (+/+) on plasma leptin was analyzed at two defined states of ontogeny. First, the influence of gene dose on plasma leptin
was determined during the perinatal phase. Second, the roles of gene dose and of several physiological and cellular parameters known to
influence plasma leptin were studied at the age of 10 days, because preceding observations had indicated that the gene dose would
become effective at this age. In order to delineate the influence of gene dose against those of various metabolic parameters, control of food
supply was established by artificial rearing and control of metabolic expenditure either by imposing a mild cold load or by norepinephrine
infusion to activate non-shivering thermogenesis. Measurements included plasma leptin and the mRNA concentrations in the brown (BAT)
and white (WAT) adipose tissue, metabolic rate (MR) as an estimate of the state of sympatho-adrenal activation (SAA), net energy storage,
determined as the difference between the energy supplied with the milk and metabolic energy dissipation, as an estimate of the global
energy flux, and body fat content as an estimate of the global lipid content of the adipocytes. Evaluation of the data by subjecting them to
2-way ANOVA and to simple or multiple regression analysis produced the following results.


1. The earliest evidence for an influence of the gene dose on plasma leptin was found immediately after birth, i.e., prior to the start of
triglyceride storage, but could not be discovered immediately before birth.


2. The plasma concentration of leptin in wildtype animals declines during the first to fifth week of life. The decline is most rapid during the
first 2 weeks and varies more strongly during this period than subsequently. Rapid sustained changes that might have compromised the
measurements made in 10 day old pups did not occur at that age.


3. Artificial rearing under moderate cold load conditions does not eliminate the difference between the high plasma levels of the fa/fa
animals in comparison to +/fa and +/+ animals, as they are observed under natural rearing conditions.


4. Artificial rearing for 2 days in thermoneutral conditions leads to comparable minimum energy consumption without changes in body fat
storage in both fa/fa and +/fa pups and eliminates the stimulatory effects responsible for the high plasma leptin levels in the fa/fa animals.


5. Under continuous application of norepinephrine for 6 days in artificially reared pups, low doses are sufficient to adjust plasma leptin of
the fa/fa pups to the level of +/fa pups, and reduction of body fat content is not a prerequisite for this effect.


6. For plasma leptin levels <10 ng/ml, irrespective of raising the animals naturally or artificially, a strong influence of leptin mRNA
concentration in the BAT may be stated which explains 60% of plasma leptin variations, while leptin mRNA concentration in the WAT
accounts for only 10% of the plasma leptin variations. In addition, a weak genotype effect could be confirmed.


7. For plasma leptin levels >10 ng/ml, which were observed mainly in fa/fa pups, body fat content was confirmed to be influential and
accounted for 50% of the variations in plasma leptin. The influence of gene dose was neither associated with differences in BAT and Wat
leptin mRNA concentrations nor with the state of sympathoadrenal activation.


8. Analysis applied to the control of plasma leptin at levels <10 ng/ml, when leaving out of account the influences of leptin mRNA
concentrations in the BAT and WAT, revealed a positive relationship with body fat content accounting for 50% of plasma leptin variations
and a negative relationship with the state of sympathoadrenal activation accounting for 10% of the plasma leptin variations, while
gene-dose influences could not be detected.


9. Leptin mRNA concentrations in the BAT correlated closely with the state of sympathoadrenal activation which accounted for 90% of their
variations. Only 50% of the variations in WAT leptin mRNA concentration could be attributed to any one of the investigated variables, with
net energy supply emerging as the dominant parameter and both body fat content and state of sympathoadrenal activity being less
influential. The difference in the control of leptin mRNA concentration in BAT and WAT may be related to the facts that net energy supply is
loosely connected to energy flux in the WAT whereas MR as the estimate for the sympathoadrenal state of activity is closely connected to
energy flux in the BAT.


The results suggest the following conclusions:


(a) Immediately after birth the 'fa' gene defect is effective as a factor elevating plasma leptin concentration in rat pups.


(b) In 10-day-old rat pups autocrine control of leptin production, due to the action of the circulating hormone on leptin receptors of the fat cell
as the source of leptin, is not yet effective. Since a feedback relationship between leptin and its production was shown to exist in the BAT at
this age, it is most likely established by central nervous leptin receptors ultimately controlling sympathoadrenal activity. For leptin production
in the WAT, the available evidence suggests some kind of feedback control of leptin mRNA expression in which local energy flux seems to
be involved.


c) Apart from the feedback relationships identified in this study between plasma leptin and leptin mRNA expression, circumstantial
evidence suggests the involvement of additional unknown control mechanisms which are effective in the conditions of natural as well as
artificial rearing involving some degree of cold stress, but are eliminated in thermoneutral conditions.