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Differenzierung mitochondrialer und nicht-mitochondrialer Quellen von reaktiven Sauerstoffspezies in PC12-Zellen unter Hypoxie

Sell, Alexandra


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Hypoxie , Sauerstoff , PC12-Zelle
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Anatomie und Zellbiologie, eingereicht über das Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und -Embryologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.08.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 02.11.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Der O2-messende Mechanismus chemosensitiver Paraganglien von Säugetieren ist nach wie vor nicht vollständig aufgeklärt. Als Modell für
Studien am O2-messenden Mechanismus Hypoxie-sensitiver Paraganglien dient eine Tumorzelllinie aus dem Nebennierenmark der Ratte
(PC12-Zellen), da sie eine sehr hohe Sensitivität gegenüber O2-Schwankungen aufweist. In PC12-Zellen konnte unter Hypoxie ein
intrazellulärer Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beobachtet werden. Es ist jedoch noch nicht bekannt, welches zelluläre
Enzymsystem für diese Hypoxie-bedingte ROS-Produktion in PC12-Zellen verantwortlich ist.


Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mitochondriale von nicht-mitochondrialen ROS-Quellen unter Hypoxie in PC12-Zellen zu differenzieren.
Die PC12-Zellen wurden in Gegenwart der Redox-sensitiven Fluoreszenzindikatoren Dihydrorhodamin 123 und 2´,7´-Dichlorofluorescin
Diazetat unter Normoxie und Hypoxie inkubiert. Durch intra-zellulär gebildete ROS werden beide Substanzen in ihre fluoreszierenden
Metaboliten Rhodamin 123 und 2´,7´-Dichlorofluorescein oxidiert. Anhand der Rhodamin 123- bzw.
2´,7´-Dichlorofluorescein-Fluoreszenzintensität konnte die intrazelluläre ROS-Produktion in den PC12-Zellen am LSM gemessen werden.
Beide Fluoreszenzindikatoren eigneten sich gleichermaßen für die Messung intrazellulär gebildeter ROS.


In allen Experimenten wurde bei PC12-Zellen ein Hypoxie-bedingter ROS-Anstieg festgestellt. Um die Beteiligung der Mitochondrien bei
der ROS-Produktion nach-zuweisen, wurden die PC12-Zellen mit Thiamphenicol behandelt (T-PC12-Zellen) und mit dem
Anionenkanalblocker 4,4´-Diisothiocyanostilbene-2,2´disulfonat (DIDS) inkubiert.


Mit Ausnahme von Komplex II werden die Proteinkomponenten der vier mitochon-drialen Atmungskettenkomplexe bei Säugtieren sowohl
von mitochondrialer als auch von Kern-DNA kodiert. Thiamphenicol inhibiert die Translation der dreizehn mitochondrial kodierten
Proteinuntereinheiten der Atmungskette. Nach der Thiam-phenicol-Behandlung induzierte Hypoxie keinen ROS-Anstieg in den
PC12-Zellen. Dies zeigt eine Beteiligung mitochondrial kodierter Proteine bei der Hypoxie-bedingten ROS-Zunahme in den PC12-Zellen.


Auch die Ergebnisse DIDS-inkubierter PC12-Zellen deuten auf die Mitochondrien als die verantwortliche Quelle für den Hypoxie-bedingten
ROS-Anstieg hin. DIDS-inkubierte PC12-Zellen zeigten durch die Blockade aller zellulären Anionenkanäle eine signifikante ROS-Zunahme
unter Normoxie. Ein Austritt von intrazellulär gebildeten, auch aus extra-mitochondrialen Enzymsystemen stammenden ROS in den
Extrazellularraum wird unterbunden. Unter Hypoxie hingegen konnte keine signifikante ROS-Zunahme nach DIDS-Inkubation beobachtet
werden. Da DIDS die mitochondrialen Anionenkanäle blockiert, können die von den Mitochondrien unter Hypoxie vermehrt produzierten
ROS nicht ins Cytosol gelangen. Der intrazelluläre, Hypoxie-bedingte ROS-Anstieg wird verhindert.


Nach der erwiesenen Beteiligung der Mitochondrien bei der ROS-Produktion in PC12-Zellen wurde der ROS-generierende mitochondriale
Atmungskettenkomplex ermittelt. Hierfür wurden die PC12-Zellen und T-PC12-Zellen mit speziellen Atmungsketteninhibitoren inkubiert. Die
Behandlung von PC12-Zellen und T-PC12-Zellen mit NaN3, einem Inhibitor von Komplex IV, hatte keinerlei Einfluss auf die
Hypoxie-bedingte ROS-Produktion. Daher schieden die Komplexe III und IV als ROS-Quellen in PC12-Zellen aus. Der Komplex II wird
ausschließlich vom Kerngenom kodiert und bleibt damit auch nach Thiamphenicol-Behandlung funktionell aktiv. Er konnte nach dem
ausbleibenden ROS-Anstieg bei T-PC12-Zellen unter Hypoxie ebenfalls nicht für die Hypoxie-bedingte ROS-Zunahme verantwortlich sein.


Der spezifische Inhibitor Rotenon blockiert den Komplex I zwischen den Fe-S-Clustern und dem Ubiquinon. Rotenon-behandelte
PC12-Zellen zeigten unter Normoxie eine gesteigerte ROS-Bildung. Dieser Effekt von Rotenon wurde jedoch durch die gleichzeitige
Inkubation mit dem Flavoproteininhibitor DPI reduziert. DPI hemmt den Komplex I zwischen der NADH-Bindungsstelle und den
Fe-S-Clustern durch Bindung an die FMN-Komponente von Komplex I. DPI alleine führte unter Normoxie zu keiner veränderten
ROS-Produktion in PC12-Zellen. Ebenso verhielt es sich bei T-PC12-Zellen, die mit Rotenon und Rotenon + DPI gleichzeitig inkubiert
wurden.


Diese Untersuchungsergebnisse identifizieren den Komplex I als ROS-Quelle in PC12-Zellen. Er scheint vor der Rotenon-Bindungsstelle
über ein 'Elektronenleck' zu verfügen, an dem die Elektronen die Elektronentransportkette verlassen.


Zusammengefasst ergaben die Untersuchungen, dass die Mitochondrien für den Hypoxie-bedingten ROS-Anstieg in den PC12-Zellen
verantwortlich sind und die ROS in den PC12-Zellen vom mitochondrialen Komplex I gebildet werden.
Kurzfassung auf Englisch: The O2-sensor mechanism of mammalian chemosensitive paraganglia is still unresolved. A tumor cell line (PC12-cells) derived from the rat
adrenal medulla is highly sensitive to changes in pO2 and serves as a model to investigate this O2-sensor mechanism. In PC12 cells, an
intracellular increase of reactive oxygen species (ROS) was observed during hypoxia, but it is still unknown, which cellular enzyme system is
responsible for this hypoxia-induced increase of ROS.


It was the aim of this study to differentiate mitochondrial from non-mitochondrial sources of increased ROS-generation during hypoxia in
PC12-cells. PC12-cells were exposed to the redox-sensitive inicators dihydrorhodamine 123 and 2´,7´-dichloro-fluorescin-diacetate during
normoxia and hypoxia. These non-fluorescent dyes are oxidized by intrazellular ROS to their fluorescent metabolites rhodamine 123 and
2´,7´-dichlorofluorescein. By measuring this fluorescence by laser scanning microscopy (LSM) the intracellular production of ROS in
PC12-cells was detected.


In all experiments an increased ROS-production was observed in PC12-cells exposed to hypoxia. To determine the involvement of
mitochondria in this hypoxia-induced ROS- generation, PC12-cells were treated with thiamphenicol (T-PC12-cells) and incubated with the
anion channel blocker 4,4´-diisothiocyanostilbene-2,2´disulfonate (DIDS).


With the exception of complex II, the mammalian mitochondrial respiratory chain complexes are encoded by both mitochondrial and nuclear
DNA. Thiamphenicol inhibits the translation of the 13 mitochondrially encoded subunits of the respiratory chain. After treatment of
PC12-cells with thiamphenicol hypoxia did not induce an increased ROS-production. This shows that mitochondrially encoded proteins are
involved in the hypoxia-induced augmented ROS-generation in PC12- cells.


The results obtained from PC12-cells after incubation with DIDS also demonstrate mitochondria as the source of the hyoxia-induced
increase of ROS. PC12-cells treated with DIDS showed a significantly enhanced ROS-production under normoxia because the efflux of all
intracellularly, both from mitochondrial and non-mitochondrial enzyme systems produced ROS is inhibited. During hypoxia DIDS did not
induce a significantly increased ROS-generation in PC12-cells. As DIDS is blocking the mitochondrial anion channels, the ROS that are
increasingly produced within the mitochondria under hypoxia do not cross the mitochondrial membrane in sufficient amount to be
detectable in the cytosol. Thus, an intracellular, hypoxia-induced increase of ROS is prevented.


After the involvement of mitochondria in ROS-production in PC12-cells was shown, the ROS-generating mitochondrial complex was
identified by incubating PC12-cells and T-PC12-cells with specific inhibitors of the respiratory chain. Treating PC12-and T-PC12-cells with
sodium azide, a complex IV inhibitor, had no influence on hypoxia-induced ROS-production. Therefore, the complexes III and IV seemed not
to cause the augmented ROS-generation during hypoxia in PC12-cells. Complex II is encoded only by nuclear DNA and, therefore, is still
functionally active after treatment with thiamphenicol. Because of the absence of an increase of ROS in T-PC12-cells, complex II is also not
responsible for the hypoxia-induced enhanced ROS-production.


Rotenone blocks complex I between the Fe-S-clusters and ubiquinone. Rotenone-treated PC12-cells showed an increased
ROS-production during normoxia. This effect of rotenone was reduced by the additional incubation with the flavoprotein inhibitor
diphyleneiodonium (DPI). DPI inhibits complex I between the binding site of NADH and the Fe-S-clusters by binding to the FMN-compound
of complex I. DPI alone did not change the ROS-generation under normoxia. The same was observed in T-PC12-cells after incubation with
rotenone or with rotenone in the additional presence of DPI.


From the present data it can be deduced that the source of hypoxia-induced ROS-production is the mitochondrial complex I in PC12-cells.
Complex I seems to possess an electron leak site upstream from the rotenone binding site, where the electrons leave the electron transport
chain.


In conclusion, mitochondria are responsible for the hypoxia-induced increase of ROS in PC12-cells, and ROS are produced by the
mitochondrial complex I in PC12-cells.