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Isolierung und Charakterisierung von zellulären Interaktionspartnern des Matrixproteins M1 des Grippevirus Influenza A

Reinhardt, Jens


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Influenza A , Matrixprotein M1 , Grippevirus
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Virologie, Philipps-Universität Marburg und Robert-Koch-Institut, Berlin
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 30.10.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Influenzaviren sind die Erreger der weltweit verbreiteten Virusgrippe. Diese Erkrankung führt bei uns jeden Winter zu Grippewellen, die sich
in manchen Jahren zu Epidemien ausweiten können. Das Influenza A Virus, der Prototyp der Orthomyxoviren, ist darüber hinaus in der
Lage, Pandemien mit zum Teil dramatischen Ausmaßen auszulösen.
Das Matrixprotein M1 der Influenza A Viren hat neben seiner strukturellen Rolle im Viruspartikel auch unterschiedliche regulatorische
Funktionen im viralen Replikationszyklus. Verschiedene Experimente deuten darauf hin, dass zumindest ein Teil dieser Funktionen durch
eine Interaktion des viralen M1-Proteins mit zelluläre Komponenten vermittelt werden. Ziel dieser Arbeit war die Isolierung und
Charakterisierung solcher zellulären Komponenten.


In einem Hefe Zwei-Hybrid-Screen wurden 1,6 x 106 unabhängige Klone einer HeLa-cDNA-Genexpressionsbibliothek nach spezifischen
Interaktionspartnern des M1-Proteins durchsucht. Dabei wurden unter anderem vier cDNAs mit Teilen der kodierenden Sequenz des
RACK1 (Rezeptor der aktivierten C-Kinase (PKC)) isoliert. RACK1 besteht aus sieben sogenannten WD-Repeat-Domänen, die als
Protein-Protein-Adaptoren fungieren und ist hochgradig konserviert. Die Aminosäuresequenzen der homologen Proteine von Mensch,
Schwein und Huhn sind identisch.

Die gefundene Interaktion ließ sich in einem biochemischen Ansatz bestätigen. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass diese Interaktion
zwischen den M1-Proteinen von Influenza A Virusstämmen mit unterschiedlicher Wirtsspezifität (Mensch, Schwein und Geflügel) und den
entsprechenden (identischen) RACK1-Proteinen konserviert sind. Dies kann als Hinweis dafür gesehen werden, dass die RACK1-Bindung
durch das M1-Protein eine zentrale Rolle bei der Virusvermehrung spielt.
Bei der Charakterisierung der Funktion der analysierten Interaktion konnte gezeigt werden, dass das M1-Protein durch die zelluläre
Proteinkinase C, die auch an RACK1 bindet, phosphoryliert werden kann. Deshalb kann angenommen werden, dass RACK1 als
PKC-Adaptor eine Rolle bei der M1-Phosphorylierung spielt.
Außerdem wurde gefunden, dass eine Veränderung der RACK1-M1-Protein-Stöchiometrie im Verlauf einer Influenza A Virus-Replikation
zu einer Inhibition der M1-Proteinexpression führt.
Kurzfassung auf Englisch: The influenza virus is world-wide pathogen which leads to seasonal waves of flu (influenza). The prototype of orthomyxoviruses, the influenza
A virus, also has the potential to cause pandemics with sometimes dramatic outcome.
Beside its structural role within the virion, the matrix protein M1 of influenza A virus also has different regulatory functions in the viral
replication cycle. Some experiments indicate that at least some of these functions are mediated by cellular interaction partners of the viral
M1 protein. The aim of this work was the isolation and characterization of such cellular components.
Using a yeast two hybrid system, a total of 1,6 x 106 independent clones of a HeLa-cDNA library were screened for specific interaction
partners of the M1 protein. Among others, four cDNAs coding for the C-terminal part of RACK1, the receptor of the activated C-kinase
(PKC), were isolated. RACK1 consists of seven WD repeat domains known to be involved in protein-protein interactions. The protein is
highly conserved. The amino acid sequences of the human, porcine and avian homologues are identical.
This newly identified interaction was confirmed in a biochemical assay. It was also shown that this interaction was conserved for the M1
proteins of influenza A virus strains with specificity for different hosts (human, swine, poultry) and the corresponding (identical) RACK1. This
points to a crucial role for the RACK1-M1 interaction in the viral replication cycle.
During the characterization of this interaction the M1 protein was found to be phosphorylated by the PKC which also binds to RACK1. For
that reason it is assumed that RACK1 plays a role as a PKC adapter for the M1 phosphorylation.
Furthermore, it was shown, that a change in the stochiometry of the RACK1-M1 interaction in the infected cell leads to a depletion of the M1
expression.