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Isolierung und Analyse eines Bindungsglobulins für Herzglykoside aus Rinderblut

Kost, Holger


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Herzglykosid , Bindungsglobulin , Rinderblut , Rind
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie und Endokrinologie
Fachgebiet: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 26.10.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 29.10.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Die pflanzlichen Herzglykoside Ouabain und Digoxin regulieren nach neueren Erkenntnissen in Säugetieren als Steroidhormone der
Nebenniere den Salz- und Wasserhaushalt. Da Steroidhormone gebunden an spezifische Bindungsproteine im Blut transportiert werden,
sollte ein neu nachgewiesenes Bindungsprotein für Herzglykoside aus Rinderblut gereinigt und weiter charakterisiert werden.
Nach dem Nachweis des Herzglykosidbindungsproteins CGBG durch Affinitätsmarkierung mit dem proteinreaktiven Digoxigeninderivat
N-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-o-methyl-aminocaproat (HDMA) gelang es spezifische Antikörper zu gewinnen. Damit konnte das
Bindungsglobulin CGBG aus der Globulinfraktion des Rinderserums 900 000-fach gereinigt werden. Hierzu waren eine Vorreinigung des
Proteins am Kationenaustauuscher CM-Sephadex, eine Affinitätschromatographie an einer spezifischen Antiköpersäule und eine
Nachreinigung an der Anionenaustauschersäule Phenomenex Biosep DEAE erforderlich. Die Proteinausbeute der in 3 Tagen
durchzuführenden Proteinreinigung betrug 0,0001%.


Das Herzglykosidbindungsprotein ist ein Glykoprotein von Mr 90 kDa in der SDS-PAGE. Der N-Terminus ist durch Pyroglutamat blockiert.
Nach Deblockierung mit Pyroglutamase kann durch Edman Abbau die Sequenz ALPNVETSV bestimmt werden. Für sie und eine weitere
mit Lys-C erhaltene Sequenz KDLESHYLFERH, sowie eine durch CNBr-Spaltung erhaltene Sequenz GKLFNIVNKXQQAL fanden sich in
den SwissProt- und TrEMBL-Datenbanken keine Sequenzhomologien. Das Protein ist somit bisher unbekannt. Der Kohlenhydratanteil des
CGBG enthält u.a. Neuraminsäuren, wie durch Interaktion mit verschiedenen Lektinen bestimmt werden konnte. Die N-glycosidisch am
Protein gebundenen Kohlenhydrate tragen 10-15% zur Molmasse bei. Unterschiedliche Glykosylierungsmuster erklären die Heterogenität
des IEP des nativen Proteins zwischen pH 4,4 und 5,6; denn nach Deglykosylierung ist der IEP 5.6. Mittels Molekularsiebchromatographie
ergab sich für das native CGBG eine Molmasse von 820 kDa und unter denaturierende Bedingungen von 180 kDa. Es wird daraus
geschlossen, daß das Herzglykosidbindungsprotein ein Pentadimer von 180 kDa ist, in dem die Monomere von 90 kDa durch
Disulfidbrücken verknüpft sind.


Mittels Affinitätsmarkierung mit HDMA und mittels Tryptophanfluoreszenzlöschung wurden die spezifische Interaktion des gereinigten
Proteins mit Herzglykosiden nachgewiesen. Es gelang 2 Bindungsstellen unterschiedlicher Affinität von Kd1 = 2,4 nM und von Kd2 = 500 nM
nachzuweisen. Das Protein interagiert nicht mit anderen Steroidhormonen.


Gegen das isolierte 90 kDa-Herzglykosidbindungsprotein konnten in Kaninchen spezifische polyklonale Antikörper erzeugt werden. Sie
erkannten nur die 90 kDa Proteinbande in einer teilweise gereinigten Proteinfraktion.
Kurzfassung auf Englisch: In contrast to the general assumption, ouabain and digoxin, which are plant-derived cardiac glycosides, are steroid hormones of the
mammals. They regulate the salt and water metabolism. In general, steroid hormones are transported in blood as complexes with steroid
binding proteins. Hence it was the intention of this work to identify and to characterize such a binding protein for cardiac glycosidse in
bovine blood.


The cardiac glycoside binding globulin (CGBG) identified in a partially purified serum preparation by affinity labeling with the
protein-reactive digoxigenin derivative N-hydroxysuccimidyl-Digoxigenin-3-O-methyl-aminocaproate (HDMA) was used to immunize
rabbits. The antibodies raised were immoblilized to prepare an affinity column. This was an essential step to purify CGBG 900,000-fold
from bovine blood serum. Purification was performed in 3 days. It included the following steps: Ammonium sulfate precipation (50%),
CM-Sephadex cation exchange chromatography, affinity chromatography on an anti-CGBG Sepharose Fast Flow column, anion exchange
chromatography on Phenomenex BioSep DEAE. The protein yield of pure CGBG was 0.0001 %


The isolated cardiac glycoside binding protein shows a band at 90kDa on SDS-PAGE. Its N-terminus is blocked by pyroglutamate. The
amino acid sequence ALPNVETSV was determined when CGBG was digested with pyroglutamatase. Other sequences obtained were
KDLESHYLFERH (digestion with Lys-C) and GKLFNIVNKXQQAL (hydrolysis with CNBr). All sequences were not found in data banks
(SwissProt and TREMBL). CGBG contains N-glycosidic bound carbohydrates which contribute to 10-15% of the molecular mass.
The IEP of the native protein is between pH 5.6 and 4.4. Deglycosilated protein shows only one spot at 75kDa and an IEP at pH 5.6 in
2D-Electrophoresis. The calculated mass from size exclusion chromatography is 820 kDa for the native and 180 kDa for the denatured
protein. It is concluded that native CGBG circulates as an pentadimer of 90 kDa monomers that are covalently dimerized by disulfide bonds


The intrinsic tryptophane fluorescence quenching experiment using cardiac glycosides as ligands indicates two binding sites with a high
(KD1 = 2.4 nM) and low (KD2 = 500 nM) affinity binding site. Polyclonal antibodies raised in rabbits against the CGBG recognise specifically
the cardiac glycoside binding globulin in a semipurified preparation of CGBG.