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Charakterisierung der PII-P Phosphatase in Cyanobakterien

Irmler, Angelika


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Cyanobakterium , PII-P Phosphatase
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Mikro- und Molekularbiologie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.07.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 02.08.2001
Kurzfassung auf Deutsch: In Cyanobakterien wird das Signaltransduktionsprotein PII in Abhängigkeit der Kohlenstoff- und Stickstoffversorgung der Zellen durch eine
Kinase phosphoryliert und durch eine Mg2+-abhängige Phosphatase dephosphoryliert. Zunächst wurde die beteiligte Phosphatase in
einem teilgereinigten Extrakt aus Synechococcus PCC 7942 biochemisch charakterisiert. Dabei zeigte sich bereits eine synergistische
Hemmwirkung durch ATP und 2-Oxoglutarat. Das Inhibitionsmuster und die Mg2+-Abhängigkeit ließen eine Phosphatase eukaryontischen
Typs, eine PP2C-Phosphatase vermuten.


Die angestrebte Darstellung der PII-P Phosphatase aus Synechococcus PCC 7942 Zellen gelang aufgrund zu geringer Ausgangsmengen
nicht.


Mittels reverser Genetik gelang es jedoch im komplett sequenzierten Genom von Synechocystis PCC 6803, eines nahen Verwandten von
Synechococcus PCC 7942 das Gen der PII-P Phosphatase zu identifizieren. Die Inaktivierung des offenen Leserahmens sll1771 (pphA)
führte zu der PII-P Phosphatase defizienten Mutante MPphA. MPphA besitzt ein hochphosphoryliertes PII-Protein und ist in der
Dephosphorylierung von PII-P gehemmt. PphA ist somit die einzige spezifische PII-P Phosphatase.


Phänotypisch weist MPphA bei Wachstum mit Nitrat einen leicht reduzierten Gehalt an Phycobiliproteinen auf, scheidet hohe Mengen an
Nitrit aus und unterscheidet sich aber ansonsten nicht vom Wildtyp. Untersuchungen zur Nitrataufnahme wiesen darauf hin, daß
phosphoryliertes und ligandiertes PII-Protein für die Nitrataufnahme notwendig ist. Unter CO2-limitierenden Bedingungen unterliegt MPphA
einer Kohlenstoffchlorose. Die mögliche Ursache könnte die Inaktivierung oder die fehlende Aktivierung eines hochaffinen
Ci-Transportsystems, evt. cmpABCD durch das phosphoryliert-vorliegende PII-Protein sein.


Die biochemische Analyse von PphA zeigte, daß PphA als Substrate außer PII-P auch an Serin/Threoninresten phosphoryliertes P-Casein,
P-Histon, sowie synthetische Oligopeptide und p-NPP annimmt. Auch ein an einem Tyrosinrest phosphoryliertes Oligopeptid wird
dephosphoryliert.


Die Aktivität von PphA wird in Anwesenheit von ATP durch 2-Oxoglutarat vollständig und durch Oxalacetat, Succinat und weitere
Metaboliten des C- und N- Stoffwechsels intermediär gehemmt. ATP, ADP und GTP alleine hemmen bereits partiell. Diese Hemmeffekt
werden über die Ligandierung des PII-Proteins mit diesen Metaboliten vermittelt und stellen eine metabolische Regulation der PII
Phosphorylierung dar. Die Stammbaumanalyse zeigte, daß PphA zur Gruppe I bakterieller PP2C-Phosphatasen gehört. PphA stellt in
dieser Gruppe die erste Phosphatase dar, deren Funktion und Substrat in vivo identifiziert sind.
Kurzfassung auf Englisch: The signal transduction protein PII of Cyanobacteria is phosphorylated by a kinase and dephosphorylated by a Mg2+ dependent
phosphatase in dependence of the carbon and nitrogen supply. For initial biochemical characterization of the PII specific phosphatase a
partly purified extract from Synechococcus PCC 7942 was used. As a result, a synergistic inhibition by ATP and 2-oxoglutarate was
apparent. The pattern of phosphatase specific inhibitors and the Mg2+ dependence indicated similarities between PII-P phosphatase and
eukaryotic type PP2C-phosphatases. Due to the low abundance of the PII-P phosphatase in Synechococcus PCC 7942 cells
microchemical analysis was not succesfull.


In contrast, sequence analysis and reverse genetics led to the identification of the gene of PII-P phosphatase of Synechocystis PCC 6803
a closed relative of Synechococcus PCC 7942. The inactivation of the open reading frame sll1771 (pphA) resulted in the PII-P
phosphatase deficient mutant MPphA. MPphA has a highly phosphorylated PII protein and is severly impaired in the dephosphorylation of
PII-P. PphA is therefore the only specific PII-P phosphatase.


Nitrate grown MPphA is phenotypically indifferent to the wildtype with the exception of a slightly reduced amount of phycobiliproteins
combined with the excretion of high quantities of nitrite. Investigations concerning the uptake of nitrate suggest that a phosphorylated and
liganded PII-protein is necessary for nitrate uptake. Under CO2-limiting conditions, MPphA undergoes a carbon chlorosis. A possible
reason could be the inactivation or the missing activation of a high-affinity Ci- transport system like cmpABCD by the phosphorylated
PII-protein.


Biochemical analysis of PphA revealed that in addition to PII-P other serine/threonine phosphorylated proteins such as P-casein,
P-histones, p-NPP and synthetic oligopeptides serve as substrates. An oligopeptide phosphorylated on a tyrosine residue becomes also
dephosphorylated.


The activity of PphA is completely inhibited by 2-oxoglutarate in the presence of ATP. A partly inhibition is observed in the presence of ATP
by oxalacetic acid, succinate and other metabolites of the N- and C-metabolism . ATP, ADP and GTP alone are able to a partly inhibition.
These inhibitory effects are mediated by the ligandation of the PII protein with these metabolites and represent a metabolic regulation of PII
phosphorylation.


Phylogenetic analysis showed that PphA belongs to group I of bacterial PP2C-phosphatases. PphA is the first phosphatase of this group
whose in vivo substrate and function are identified.