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Die Bedeutung tonoplastenständiger Ca2+-Transporter für die zytoplasmatische Signalübertragung und Ca2+-Homöostase bei Zea mays L.-Koleoptilen

Albach, Gerald


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Zea mays L.-Koleoptil , Ca2+-Transporter , Ca2+-Homöostase
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Botanisches Institut I
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.1999
Erstellungsjahr: 1999
Publikationsdatum: 10.07.2001
Kurzfassung auf Deutsch: An isolierten Einzel-Vakuolen und Vakuolensuspensionen aus Z. mays L.-Koleoptilen konnte erstmals gleichzeitig an einem Objekt mittels Patch-Clamp-Technik
(wv-, co-und ci-Konfiguration), extravakuolärer Ca2+-Bestimmung (Ca2+-selektive Mini-Elektroden) und intravakuolärer pH-Bestimmung (Acridinorange-absorption)
direkte Nachweise zum Ca2+-Transport in die Vakuole (Ca2+-ATPase und H+/Ca2+-Antiporter), sowie zur Ca2+-Freisetzung aus der Vakuole
(InsP3-Rezeptor-Kanal-Komplex (InsP3R) und Ryanodin-Rezeptor-Kanal-Komplex (RyR)) erbracht werden.


I. Ca2+-Transport in die Vakuole durch primär aktive Ca2+-ATPase und sekundär aktiven H+/Ca2+-Antiporter:


Mit Vakuolensuspensionen wurden Versuche zur Aktivität der zur Energetisierung des sekundär aktiven H+/Ca2+-Antiporters verantwortlichen Protonenpumpen, der
vakuolären H+-ATPase (v-H+-ATPase) und Pyro-phosphatase (PPase), durchgeführt.


Die Vakuolen von Z. mays L. wiesen nach der Präparation zum Versuchsmedium einen pH-Gradienten von 1,5 Einheiten auf. Die Aktivität der v-H+-ATPase und
PPase resultierte in einer weiteren Absenkung des vakuolären pH um 0,9 Einheiten auf pH 4,8 ± 0,2 in einem Zeitraum von 30 min bzw. 4 - 6 h. Die halbmaximale
Aktivierung der Protonentranslokation der v-H+-ATPase durch ATP wurde auf 125 µM bestimmt. Die halbmaximale Inhibition der Protonentranslokation der
v-H+-ATPase durch Bafilomycin wurde auf 120 pM bestimmt.


An Vakuolensuspensionen konnte ein ATP-abhängiger Ca2+-Transport in die Vakuole beobachtet werden, der durch Bafilomycin nicht hemmbar war. Der
ATP-abhängige Ca2+-Fluß hatte eine maximale Transportrate von 152 pmol.m-2.s-1.


Die Auswirkung von 10 µM bis 1 mM Ca2+ auf den im Gleichgewicht befindlichen Protonengradienten zeigte einen partiellen, konzentrationsabhängigen Abbau
desselben. Die Ergebnisse sprechen für die Existenz einer tonoplastenständigen Ca2+-ATPase und H+/Ca2+-Antiporters.


II. Ca2+-Freisetzung aus der Vakuole durch InsP3R und RyR:


Vakuolensuspensionen von Z. mays L. reagierten auf den Zusatz von Inositol-1,4,5-triphosphat (InsP3) und Ryanodin mit einer von [Ca2+zyt] abhängigen
Ca2+-Freisetzung.


Der InsP3-aktivierbare Ca2+-Fluß hatte eine Transportrate von 124 pmol.m-2.s-1 und war in Gegenwart von Ryanodin auf 279 pmol.m-2.s-1 steigerbar.


Mit Hilfe der PC-Technik konnte in der wv-, co- und ci-Konfiguration) nachgewiesen werden, daß die durch InsP3 induzierte Ca2+-Freisetzung der Vakuolensuspension
von einem InsP3R mit 12 pS Leitfähigkeit verursacht wurde. Die InsP3R-Dichte wurde zu 1 InsP3R.7 µm-2, bei einer Transportrate von 103 nmol.m-2.s-1 bestimmt. Der
InsP3R hatte die relative Selektivitätsreihe von PCa2+: PSr2+: PBa2+: PMg2+: PK+ = 105 - 139 : 18 : 8 : 1,7 : 1. Die Leitfähigkeitsreihe des InsP3R war ([50 mM X2+] auf
der vakuolären Seite): Ba2+> Sr2+ > Mg2+ » Ca2+ = 21,1 : 17 : 15,5 : 12 pS. Dies spricht für eine voneinander abhängige Permeation divalenter Kationen durch die
Kanalpore. Der InsP3R war durch La3+ (halbmaximale Inhibition 8 µM), 100 µM Gd3+ und 1 mM Zn2+ auf der vakuolären Seite reversibel hemmbar.


Der Ryanodin-aktivierbare Ca2+-Fluß durch den Tonoplasten hatte eine Transportrate von 147 pmol.m-2.s-1 und war in Gegenwart von InsP3 auf 199 pmol.m-2.s-1
steigerbar.


Durch Analysen in der wv- und co-Konfiguration konnte nachgewiesen werden, daß die durch Ryanodin induzierte Ca2+-Freisetzung der Vakuolensuspension von
einem RyR mit 122 pS Leitfähigkeit verursacht wurde. Der RyR hatte die relative Permeabilität von PCa2+:PK+= 0,8:1. Der RyR war durch 1 µM zyklische
Adenosin-Diphosphat-Ribose aktivierbar und durch 1 - 100 µM Ruthenium Rot hemmbar.


III. Es konnten drei weitere Kationenkanäle nachgewiesen werden:


1. In der wv-, co- und ci-Konfiguration konnte ein spannungsabhängiger Kationenkanal vom FV-Typ mit einer Leitfähigkeit von 19 pS nachgewiesen werden. Der
FV-Kanal hatte die relativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1:0,8:1,7:1,4:0,16.


2. In der ci-Konfiguration konnte ein spannungsabhängiger Kationenkanal vom SV-Typ mit einer Leitfähigkeit von 37 pS nachgewiesen werden. Der SV-Kanal hatte die
relativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1:0,7:1:1,3:0,14.


3. In der ci-Konfiguration konnte ein spannungunabhängiger Kationenkanal mit einer Leitfähigkeit von 7 pS nachgewiesen werden. Der Kationenkanal hatte die
relativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1 : 0,5 : 0,9 : 0,4 : 0,4.