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Untersuchungen zum Vorkommen von Wachstumsfaktoren (aFGF, bFGF, TGF-[alpha]) und deren Rezeptoren (FGF-R, EGF-R) in der Plazenta des Rindes

Weise, Simone


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Rind , Plazenta
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 05.07.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Untersuchung war es, die Expression und Verteilung der Wachstumsfaktoren aFGF, bFGF, TGF-[alpha] und ihrer Rezeptoren
FGF-Rezeptor und EGF-Rezeptor in Plazentomen von Rindern in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Gravidität sowie der Geburt zu erfassen.
Plazentome wurden von jeweils drei 150, 220, 240 und 270 Tage tragenden Kühen, sowie von drei Geburtstieren, bei denen eine Sectio
caesarea durchgeführt worden war, gewonnen, formalinfixiert und paraffineingebettet.


Die eingesetzten immunhistochemischen Nachweisverfahren unter Verwendung von biotinylierten Sekundärantikörpern und der
ABC-Methode erwiesen sich bei Auswahl geeigneter Reagenzien und Versuchsprotokolle zum Nachweis von aFGF, bFGF, FGF-Rezeptor
und EGF-Rezeptor als geeignet. Dabei mußten, um unspezifische Färbereaktionen eindeutig von spezifischen Reaktionen abgrenzen zu
können, bei jedem Versuch geeignete Positiv- bzw. Negativkontrollen (Isotypenkontrollen der Antikörper, Einsatz von definierten Positiv-
bzw. Negativkontrollen) herangezogen werden. Um weiterhin Einflüsse auf den Ablauf der immunhistochemischen Nachweisreaktion und
deren Bewertung so gering wie möglich zu halten, wurden alle Versuche unter gleichen Rahmenbedingungen von einer Person
durchgeführt. Ein geeignetes Versuchsprotokoll zum spezifischen Nachweis von TGF-[alpha] konnte nicht entwickelt werden.


Der Wachstumsfaktor aFGF konnte unabhängig vom Trächtigkeitsstadium bei weitgehend einheitlichem Färbemuster in allen untersuchten
Präparaten in allen Zellpopulationen nachgewiesen werden. Die Funktion von aFGF im Plazentom wird daher weniger im Hinblick auf
seine mitogenen Wirkungen, sondern eher im Zusammenhang mit seinen nicht-mitogenen Wirkungen (zelluläre Differenzierung,
Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels und der Zellmigration) gesehen.


Auch der Wachstumsfaktor bFGF konnte mit Hilfe von zwei verschiedenen Antikörpern in den untersuchten Plazentomen zweifelsfrei
nachgewiesen werden, wobei sich die Reaktionsmuster der eingesetzten Antikörper hauptsächlich durch ihre Reaktionen in den
epithelialen Anteilen unterschieden. Während bei beiden Antikörpern die Stromaanteile in allen untersuchten Stadien schwache bis
intensive nukleäre Signale zeigten, reagierte der monoklonale Antikörper in den epithelialen Anteilen überwiegend zytosolisch, der
polyklonale Antikörper zeigte dagegen neben schwachen zytosolischen Signalen auch schwache bis intensive nukleäre Reaktionen.
Auffallend ist die Reduktion der Immunreaktion am Tag 220, die bei beiden Antikörpern zu beobachten war. Die Reaktionen des Stromas
werden im direktem Zusammenhang mit proliferativen Prozessen und der Förderung der Angiogenese gesehen, während die epithelialen
Reaktionen mehr als Ausdruck nicht-mitogener Wirkungen (Differenzierung, Modulation der Proteinbiosynthese und -sekretion) des bFGF
interpretiert werden. Die unterschiedlichen Reaktionen der eingesetzten Antikörper können durch das Erkennen unterschiedlicher
bFGF-Isoformen erklärt werden.


Auch die Expression eines Wachstumsfaktor-Rezeptors FGF-R in den Rinderplazentomen konnte in der vorliegenden Studie gezeigt
werden, wobei die Signalintensität und Signalausbreitung in Abhängigkeit vom Trächtigkeitsstadium variierten. Das maternale Stroma
zeigte ein schwaches bis intensives Signal der äußeren Zellmembran bzw. des Zytosols der Stromazellen, wobei an den Tagen 220, 240
und unter der Geburt die Anzahl der betroffenen Zellen höher war als an den Tagen 150 und 270. Alle untersuchten Stadien zeigten im
fetalen Stroma ein nukleäres und perinukleäres Signal, welches am Tag 150 sehr schwach bis schwach war, mit zunehmender Trächtigkeit
stärker wurde und ab Tag 240 bis zur Geburt schwach bis deutlich ausgeprägt war. Das Karunkelepithel wies ein schwaches zytosolisches
und überlappend schwaches nukleäres Signal auf, welches an Tag 240 in vielen Zellen und an Tag 270 nur noch in einigen Zellen
nachweisbar war, wobei in den Präparaten auch vollständig negative Regionen auffielen. Die beiden Zelltypen des Trophoblasten (BNC
und Uninukleäre) reagierten einheitlich mit einem parazellulären und membranständigen bzw. zytosolischen Signal, welches an den Tagen
150, 220, 270 in vielen Zellen, an Tag 240 und unter der Geburt in nahezu allen Zellen auftrat. An Tag 220 fiel zusätzlich ein schwaches
nukleäres Signal einzelner Zellen auf, hier waren die Signale besonders in der Nähe großer Stromastraßen zu finden. Eine Differenzierung
zwischen FGF-Rezeptor 1 und FGF-Rezeptor 2 war allerdings nicht möglich.


Ebenso konnte die Expression des Wachstumsfaktor-Rezeptors EGF-R nachgewiesen werden, wobei das immunhistologische Signal
weitestgehend auf die epithelialen Plazentomanteile beschränkt war. Die Signalintensität und -ausbreitung variierte dabei nicht nur in
Abhängigkeit vom Trächtigkeitsstadium, sondern zeigte auch große Schwankungen zwischen den Tieren des gleichen Stadiums. Letztere
spiegeln möglicherweise unterschiedliche Ligandkonzentrationen in den jeweiligen Präparaten wider. Der Verlust des Signals unter der
Geburt erklärt sich aus der fortschreitenden Degeneration des maternalen Karunkelepithels; der Verlust der Signalintensität am Tag 220
entspricht den Beobachtungen bei bFGF.


Zusammenfassend ergibt sich, daß die Wachstumsfaktoren aFGF und bFGF sowie die Wachstumsfaktor-Rezeptoren FGF-R und EGF-R
in der zweiten Hälfte der Gravidität und/oder unter der Geburt in den Plazentomen von Rindern exprimiert werden. Damit kann die
Bedeutung dieser Faktoren für die Entwicklung und Funktion der Rinderplazenta als belegt angesehen werden.
Kurzfassung auf Englisch: This study examines the expression and the distribution of the growth factors aFGF, bFGF and TGF-[alpha] and their receptors FGF-R and
EGF-R during the second half of pregnancy and throughout parturition. Placentomes were collected from cows at days 150, 220, 240 and
270 of pregnancy and from normal-term placentas, these latter extracted by caesarean section. Each group consisted of three animals.
After removal placentomes were fixed in formalin and embedded in paraffin.


As long as the right reagents and pre-treatments of the probes were chosen, the immunohistochemical technique using biotinylated
secondary antibodies and the ABC-complex was the appropriate one for detecting aFGF, bFGF, FGF-R and EGF-R, although controls
were essential in order to distinguish between specific and non-specific immunolabelling (isotypic control of antibodies, known
positive/negative tissues). To reduce extraneous influences on the immunolabelling, all tests were prepared by myself under the same
conditions. In this investigation specific detection of TGF-[alpha] was not possible.


Immunolabelling of aFGF did not depend on the stage of pregnancy, but resulted in nearly the same staining pattern in each probe and
detected the growth factor in each cell type. It seems that in bovine placentomes aFGF does not act as a mitogen, but activates
non-mitogenic cell functions (cellular differentiation, modulation of cellular metabolism, and cellular motility and migration).


The growth factor bFGF was detected in bovine placentomes by two different antibodies, which gave different staining patterns. While the
monoclonal antibody showed cytoplasmic immunostaining of epithelial cells, the polyclonal antibody located weak to intense
immunostaining of the nuclei, concurrent with weak cytoplasmic reaction in these cells. Additionally, both antibodies were immunoreactive
in nuclei of stromal cells and showed a reduction of immunoreactivity at day 220. Stromal reactions of bovine placentomes indicate that
bFGF stimulates cell proliferation and angiogenesis, while epithelial reactions are connected with non-mitogenic cell functions (changes in
differentiated cell function, modulation of specific cellular protein synthesis). The different staining patterns could be due to the recognition
of different isoforms of bFGF.


The present study detected the expression of FGF-R in bovine placentomes during the second half of pregnancy to parturition and proved
that the staining pattern varied according to the different stages of pregnancy. Outer membranes and cytoplasm of the maternal stromal
cells stained with a weak to intensive signal, while on days 220, 240 and at parturition the number of positive cells was higher than on days
150 and 270. At each investigated stage of pregnancy foetal stromal cells had nuclear and perinuclear immunostaining, which started with
extra-weak to weak reaction on day 150, became stronger as pregnancy progressed and ended with weak to strong reactions from day
240 to parturition. Cytoplasmic signals of the caruncular epithelium cells were weak and overlapped with weak reaction of the nuclei; on day
240 many cells reacted positive while on day 270 only a few cells stained. Remarkably, some parts of the probes were absolutely negative.
The two trophoblastic cell types (BNC and columnar trophoblastic cells) reacted in the same way to positive cell membranes or cytoplasm;
on days 150, 220 and 270 many cells stained, while on day 240 and at parturition almost all cells were positive. Additionally, there was a
weak nuclear signal of single cells on day 220. This latter signal was most commonly found beside greater stromal areas. There is no
possibility of differentiation between FGF-R 1 and FGF-R 2.


EGF-R expression was also detected, whereas the staining reaction was restricted to the epithelial parts of placentomes. Intensity and
distribution of the signals did not vary only according to the stage of pregnancy but also between different animals at the same stage of
pregnancy. This probably reflects the different concentrations of EGF-R/ligand in the individual specimen. The loss of signals in at-term
placentomes can be explained by the progressive degeneration of the caruncular epithelium, while loss of signals on day 220 corresponds
to the observations at bFGF.


In conclusion, during the second half of gestation and under parturition the growth factors aFGF and bFGF, as well as their receptors
FGF-R and EGF-R, are expressed in bovine placentomes. Therefore, these proteins are important for the development and function of
bovine placentomes.