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Die Insertion von rol-Genen in zellzyklussynchronisierte Karottenzellkulturen

The Insertion of rol Genes in Cell-Cycle Synchronized Carrot Cell Suspensions

Geisler, Claudia


pdf-Format: Dokument 1.pdf (6.865 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): rol-Gen , Karottenzellkultur
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Pflanzenernährung, Abteilung Gewebekultur
Fachgebiet: Haushalts- und Ernährungswissenschaften - Ökotrophologie
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.05.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 02.07.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin festzustellen, ob über eine Synchronisierung des Zellzyklus eine gerichtete Insertion von
Fremd-DNS-Sequenzen in ein Empfängergenom (hier Daucus carota) mithilfe von Agrobacterium tumefaciens nachweisbar ist. Da eine
Insertion auch außerhalb der DNS-Synthese-Phase vorstellbar ist, sollte der Einfluß verschiedener Transformationszeitpunkte im Verlauf
des Zellzyklus (in Stunden nach dessen erneuter Anregung mit Thymidin angegeben) auf den Einbau der Fremd-DNS geklärt werden.
Durch die Verwendung eines Plasmid-Konstrukts unter der Kontrolle der eigenen Promotoren, das eine Kombination von rol-Genen
(rolABC) beinhaltete, sollte ein morphologischer Marker geschaffen werden, der eine frühe visuelle Selektion und Bonitur der durch die
Transformation bedingten Veränderungen der Phytomorphologie erlaubte.


Zur Durchführung der Versuche wurde der Zellzyklus der verwendeten Karottenzellsuspensionen (in B5-Medium mit
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure kultiviert) mithilfe von 2´-Fluoro-Desoxi-Uridin und 2´-Desoxi-Thymidin-Zugabe synchronisiert. Der Erfolg der
Synchronisation wurde über eine Bisbenzimid-Färbung mit anschließender cytophotometrischer DNS-Messung ermittelt. Das Plasmid
pPCV 002 mit der rol-Gen-Kombination ABC wurde in Agrobacterium tumefaciens inseriert. Zur Übertragung der Fremdgene in das
Karottengenom wurden die Agrobakterien mit der Daucus carota-Suspension cokultiviert, insgesamt zu 8 verschiedenen Zeitpunkten nach
Initiierung der S-Phase des Zellzyklus. Als Cokulturzeiten wurden 4, 8 und 48 Stunden verwendet. Nach Gewinnung von transgenen
Karottenpflanzen über die somatische Embryogenese wurde deren DNS nach den üblichen Präparationsmethoden (Extraktions-Kit)
aufbereitet, die Insertion der Fremdgene wurde anhand von PCR und Southern Blot bestimmt.


Die Synchronisierung des Zellzyklus erreichte im Durchschnitt eine Rate von ca. 60% der Zellen. Bereits schon recht früh konnten abhängig
von der Dauer der Cokulturzeit Unterschiede in der Embryonalentwicklung festgestellt werden. Die Bonitur der transgenen Pflanzen erfolgte
nach einem morphologischen Bonitierungs-Schema, in dem sechs sog. 'Morphotypen' unterschieden wurden. Eine eindeutige Abstufung
des Auftretens bestimmter Morphotypen zu definierten Transformationszeitpunkten oder abhängig von der Cokulturdauer konnte nicht
gegeben werden. Die Durchführung von molekularbiologischen Methoden zum Nachweis der Insertion der rol-Gene in das Pflanzengenom
(PCR) ergab, daß die ursprüngliche rol-Gen-Kombination rolABC nicht in jeder transgenen Pflanzen in toto nachweisbar war. Häufig
konnten nur einzelne rol-Gene oder Zweier-Kombinationen nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung der durchgeführten Southern Blots
konnte nur eine tendenzielle Aussage gemacht werden. Es war zu beobachten, daß die meisten auftretenden Banden nicht den erwarteten
Restriktionsfragmenten eines bestimmten Molekulargewichtsbereiches entsprachen. Deshalb wurde angenommen, daß diese
Veränderungen auf Methylierung und interne Umstrukturierungen der rol-Gen-Sequenzen zurückzuführen sind.


Abschließend kann davon ausgegangen werden, daß eine gezielte Einflußnahme auf die gerichtete Insertion von Fremd-DNS durch eine
Zellzyklussynchronisierung nicht in vollem Maße möglich ist. Es muß jedoch über die Zellzyklussynchronisierung und die variable
Cokulturdauer eine gewisse Steuerungsfunktion vorhanden sein, die zur Ausbildung von 6, und nicht beliebig vielen, Pflanzenformen führt.
Diese Hypothese wird bei der Betrachtung der Embryonalentwicklung insofern unterstützt, daß auch die Cokulturdauer bereits in diesen
frühen Entwicklungsstadien eine noch näher zu determinierende Wirkung besitzt.
Kurzfassung auf Englisch: The object of this work was to determine whether cell-cycle synchronisation could induce directed insertion of foreign DNA sequences in a
host genome (here: Daucus carota) using the Agrobacterium tumefaciens system. Since an insertion could occur beyond the S-phase of
the cell-cycle, it was necessary to determine the effect of different phases of the cell-cycle on the insertion event. In order to detect the
insertion a plasmid, containing a morphological marker (rol gene combination ABC under the own promoters) was used. The insertion of
this plasmid into genomic DNA should allow for early visual selection based on the phytomorphological alteration resulting from insertion.


Carrot cell suspensions (B5-medium with 2,4-dichlorophenoxic acid) were synchronized with 2´-Fluoro-Desoxi-Uridine and
2´-Desoxi-Thymidine. The success of the synchronisation was examined by bisbenzimide dye followed by cytophotometric measurement.
The plasmid, pPCV 002 containing rolABC, was initially inserted into Agrobacterium tumefaciens. In order to facilitate foreign gene
transfer into the carrot genome, the transformed Agrobacteria were cultivated with the Daucus carota-suspension. Transformed
Agrobacteria were added to synchronised carrot cell cultures at 8 different points post cell cycle following initiation of cell-cycle. Bacteria
and carrot cell cultures, started at each of the 8 points post cell cycle initiation, were cultured for 4, 8 or 48 hours. Plants resulting from
co-cultured carrot cells were then allowed to develop by somatic embryogenesis. The usual kits for DNA preparation were used, foreign
gene insertion was tested by PCR and Southern Blot.


Treatment of the carrot cell culture resulted in 60% synchronisation. The consequences of cocultivation could be seen early in embryogenic
development and the differences were correlated with the duration of cocultivation. Transgene plants created using the coculture method
exhibited 6 distinct morphological patterns ('morphotypes'). Correlations between the expression of particular morphotypes and the
axperimental conditions could not be found. PCR analysis of the morphotypes indicated that the original rol gene combination, rolABC, was
not integrated in every transgene plant in toto. Often, single rol genes or combinations of two rol genes could be detected using PCR.
Southern blot analysis did not clarify the nature of the insertions as bands were not of the expected molecular weight; it is supposed that
methylation or rearrangements resulted in the altered nature of the rol gene sequences.


In conclusion, the data demonstrate that there is only a limited influence of cell-cycle synchronisation on the directed insertion of foreign
DNA. There was however a discernable effect of the cell-cycle synchronisation and variable duration of the cocultivation, on the
development of six morphological types. This hypothesis is supported by the observations of altered embryogenic development wherein
cocultivation seems to have an early effect. The mechanism by which the effect is mediated has yet to be determined.