Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-4456
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2001/445/


Einfluss elektrischer Felder auf Struktur und Funktion von Trypsin

Weimer, Friederike


pdf-Format: Dokument 1.pdf (755 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Freie Schlagwörter (Deutsch): Trypsin
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Strahlenzentrum, Institut für Biophysik
Fachgebiet: Physik
DDC-Sachgruppe: Physik
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.09.1999
Erstellungsjahr: 1999
Publikationsdatum: 26.06.2001
Kurzfassung auf Deutsch: In unserer heutigen Gesellschaft kommt es vermehrt zur Einwirkung artifizieller elektromagnetischer Felder auf Lebewesen. Inzwischen
werden diesen auch vermehrt negative Einflüsse auf den Organismus zugeschrieben. Besonders diskutiert werden in diesem
Zusammenhang hochfrequente elektromagnetische Felder. Über die Wirkung von Feldern auf Biomoleküle (z.B. Proteine) im
Niedrigfrequenzbereich gibt es nicht sehr viele Studien, insbesondere nicht an in vitro-Systemen.


Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, mögliche Einflüsse eines elektrischen Feldes mit niedrigen Frequenzen auf ein geeignetes in
vitro-System zu untersuchen, wobei hier der Einfluß auf Proteine und ihre Funktion im Vordergrund stand.


Ein geeignetes Enzym für die Untersuchung fand sich in der Protease Trypsin. Als Marker für den Einfluß des elektrischen Feldes auf das
Enzym sollte die Enzymaktivität gegenüber einem geeigneten Substrat dienen. Dazu wurden mehrere Substrate in bezug auf den
Substratumsatz durch Trypsin getestet. Für die Bestimmung der spezifischen Aktivität wurden außerdem ihre molaren
Extinktionskoeffizienten bestimmt. Das Substrat BAPA erschien dabei als das geeignetste Substrat für Trypsin, so daß hier noch zusätzlich
der Km-Wert von Trypsin für dieses Substrat ermittelt wurde, um einen Hinweis für die zu verwendende Substratkonzentration zu erhalten.


Das Trypsin konnte durch die Bindung an eine Matrix im elektrischen Feld stabilisiert werden. Als Matrix wurde silanisiertes Kieselgel
verwendet, an welches das Trypsin über einen Anker aus Glutardialdehyd an die Matrix gebunden werden konnte. Dabei wurden die für
eine Immobilisierung des Enzyms geeigneten Inkubationszeiten und die anschließend gebundene Menge an Enzym bestimmt. Außerdem
wurden die Aktivität dieses immobilisierten Trypsins und die Abhängigkeit seiner Aktivität von pH-Wert und Temperatur untersucht. Es
zeigte sich, daß die Aktivität des immobilisierten Trypsins nur noch ca. 30-40 % derjenigen des löslichen Trypsins besaß. Im alkalischen
pH-Bereich ergab sich für das immobilisierte Trypsin eine erhöhte Stabilität gegenüber dem löslichen. Für den Temperaturbereich
zwischen 25 °C und 30 °C ergibt sich ein linearer Zusammenhang zwischen Temperatur und Enzymaktivität, allerdings keine erhöhte
Stabilität des immobilisierten gegenüber dem löslichen Trypsin.


Als der für die Funktion des Trypsins relevante Parameter wurde seine Enzymaktivität bestimmt. Da die Matrix optisch nicht durchlässig
war, wurde ein Durchflußsystem entwickelt, bei dem die Substratlösung kontinuierlich am Enzym vorbeigeleitet und der Substratumsatz
danach photometrisch gemessen werden konnte.


Um verschiedene strukturelle Zustände des Trypsins im elektrischen Feld untersuchen zu können, wurden der Substratlösung
denaturierende bzw. strukturbeeinflussende Reagentien zugefügt. Für die teilweise Lösung von Wasserstoffbrücken wurde Harnstoff
verwendet. Dabei zeigte sich, daß das immobilisierte Enzym nicht stabiler gegenüber Harnstoff war als das lösliche. Allerdings war eine
fast vollständige Renaturierung möglich. Eine ergänzende Störung der ionischen Wechselwirkungen im Enzym wurde durch die zusätzliche
Zugabe von Salz in die Lösung erreicht.

Für die Untersuchung des Einflusses von elektrischen Feldern auf das immobilisierte Trypsin wurden zwei Spannungsquellen verwendet,
wobei es mit der einen möglich war, bei fester Netzfrequenz die Feldstärke zu verändern, mit der anderen die Frequenz mit einer davon
abhängigen konstanten Feldstärke. Die Änderung der Absorption bei der photometrischen Enzymaktivitätsmessung wurde als Parameter
für einen Einfluß des Feldes verwendet. Dabei ergaben sich die meisten positiven Effekte bei den höchsten eingesetzten Feldstärken.
Auch zeigte sich ein Einfluß des strukturellen Zustandes des Enzyms auf die Höhe des Effektes. Über eine mögliche Abhängigkeit des
Effektes von der Frequenz ließen sich bei den Untersuchungen keine Aussagen treffen. Für die Erklärung des Einflusses durch ein
elektrisches Feld auf das Enzymmolekül wurden theoretische Überlegungen durchgeführt und mit den praktischen Ergebnissen verglichen.