Giessener Elektronische Bibliothek

GEB - Giessener Elektronische Bibliothek

Hinweis zum Urheberrecht

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-4376
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2001/437/


Untersuchung der DNA-Spaltung durch die komplexe GTPase McrBC aus Escherichia coli K-12 : In-vitro-Experimente mit den Untereinheiten McrB und McrC sowie Vorstellung eines neuen Modells zur Enzymologie von McrBC

Groll, Detlef Hartmut


pdf-Format: Dokument 1.pdf (2.703 KB)

Bookmark bei Connotea Bookmark bei del.icio.us
Freie Schlagwörter (Deutsch): Escherichia coli , DNA-Spaltung , GTPase McrBC
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 08.06.2001
Kurzfassung auf Deutsch: McrBC ist ein in Escherichia coli K-12 vorkommendes multimeres Enzym, welches die Spaltung bestimmter methylierter DNA katalysiert.
Von den derzeit rund 3500 bekannten Restriktionsenzymen stellt das McrBC-System die einzige Restriktionsendonuklease dar, deren
DNA-spaltende Aktivität obligat von der Hydrolyse von GTP abhängig ist. McrBC läßt sich nicht in das gängige Klassifizierungsschema von
Restriktionsendonukleasen einordnen und erweitert das bekannte Funktionsspektrum von GTPasen um den Aspekt der Interaktion mit
DNA. Die GTPase-Funktion des McrBC-Systems ist in einer von zwei Domänen der Untereinheit McrB lokalisiert, die auch in vivo als
verkürzte Variante (McrBs) durch Verwendung eines alternativen Translationsstarts des mcrB-Gens entsteht. Durch die bei McrBs fehlende
aminoterminale Domäne des vollständigen McrB-Proteins wird die DNA-Sequenzspezifität des Restriktionssystems bestimmt. Die
Untereinheit McrC stellt wahrscheinlich die Endonuklease des Systems dar. Für eine DNA-Spaltung in vitro werden nur die Untereinheiten
McrB und McrC benötigt, aber nicht McrBs, welchem wahrscheinlich eine regulatorische Funktion zukommt. An DNA-Sequenzen der Form
5´-RmC-3´ (mit mC = 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin oder N4-Methylcytosin) bilden McrB und McrC höhermolekulare Komplexe,
die die DNA zu spalten vermögen, wenn bestimmte Voraussetzungen gegeben sind. Hierzu gehören neben bestimmten
Milieubedingungen, die die Anwesenheit der beiden essenziellen Kofaktoren Mg2+-Ionen und GTP umfassen, besondere Eigenschaften
der DNA, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Im experimentellen Teil dieser Arbeit erfolgte die Aufreinigung der
Untereinheiten McrB und McrC sowie Varianten von McrB, die in in-vitro-Experimenten eingesetzt wurden, die hauptsächlich der
Untersuchung der DNA-Bindung und -Spaltung verschiedener DNA-Substrate durch das McrBC-System dienten. Unter Anwendung
verschiedener Methoden wurden eine Reihe von Ergebnissen erzielt, die DNA-spaltaktive McrBC-Komplexe als eine recht dynamische
Struktur zeigen. Im Einzelnen lassen die Resultate der vorliegenden Arbeit folgende Aussagen zu:


Die systemspezifische Erkennungssequenz von McrBC lautet 5´-RmC-3´. Eine singuläre Sequenz dieser Art reicht für die Entstehung
spezifischer Bindungsereignisse durch McrB aus. Sequenzen der Art 5´-RC-3´ oder 5´-YmC-3´ haben keinen Einfluss auf die
DNA-Spaltung durch McrBC.

Die spezifischen DNA-Bindungseigenschaften des McrBC-Systems sind in der aminoterminalen Domäne von McrB lokalisiert.
Diese interagiert als eigenständiges Protein (McrB1-162) nicht mit ihresgleichen und bindet im Verhältnis 1 : 1 an die
Erkennungssequenz. Auch die Bindung an nah benachbarte Erkennungssequenzen erfolgt unabhängig voneinander.

Das Protein McrB vollständiger Länge ist ein Pseudoheterodimer und bildet an spezifischen DNA-Sequenzen oligomere
Proteinkomplexe, wobei die Wechselwirkung zwischen McrB-Untereinheiten wahrscheinlich über die carboxyterminale Domäne der
Proteine erfolgt. Die beiden Kofaktoren, Mg2+-Ionen und GTP, modulieren die Oligomerisierung von McrB. Ohne die Kofaktoren
werden keine funktionellen McrBC-Komplexe gebildet.

Die Anzahl spezifischer Sequenzen sowie deren Abstand im DNA-Substrat hat, im Unterschied zu deren Orientierung, sowohl
deutlichen Einfluss auf den Aufbau von McrB-Komplexen an der DNA als auch auf die Effizienz der DNA-Spaltung durch McrBC.
Beide Effekte werden sowohl durch eine Erhöhung der Anzahl von McrBC-Erkennungssequenzen im DNA-Substrat als auch durch
Verringerung deren Abstände zueinander verstärkt. Bezüglich der DNA-Spaltung gibt es einen optimalen Abstandsbereich zweier
5´-RmC-3´-Sequenzen von ungefähr 40 bis 100 bp. Mit zunehmender Abweichung von diesem Bereich in Richtung größerer
Abstände nimmt die Spaltungseffizienz durch McrBC langsam, in Richtung kleinerer Abstände sehr schnell ab.

Die Häufigkeit der durch McrBC erzeugten DNA-Doppelstrangbrüche zwischen zwei Erkennungssequenzen wird durch die
zusätzliche Anwesenheit einer oder mehrerer Erkennungs-sequenzen im gleichen DNA-Molekül in deren Nähe deutlich erhöht, dabei
verschiebt sich die statistische Verteilung der McrBC-Spaltungen in Richtung der zusätzlichen Sequenzen. Einen ähnlichen Effekt
können auch unmethylierte Sequenzen verursachen, die einen nur wenige Basenpaare langen Abstand einer Erkennungssequenz
zum Ende eines linearen DNA-Substrats vergrößern.

Eine allosterische Aktivierung der DNA-Spaltung durch McrBC durch die Anwesenheit zusätzlicher Erkennungssequenzen in anderen
DNA-Molekülen findet nicht statt.

McrBC vermag geeignete DNA-Substrate an mehreren Stellen zwischen zwei Erkennungssequenzen durchzuspalten, wobei der
Enzymkomplex jeweils nur eine Durchspaltung in der Nähe einer der beiden Erkennungssequenzen verursacht. Die bei einem
Doppelstrangbruch in den beiden DNA-Strängen durch McrBC verursachten Spaltungen sind dabei in ihrer Position unabhängig
voneinander, McrBC verursacht also kein spezifisches Muster von Überhängen bei der Spaltung von doppelsträngiger DNA.

In den Abschnitten zwischen zwei Erkennungssequenzen, wo durch das McrBC-System DNA-Spaltungen verursacht werden, besitzt
das McrBC-System innerhalb der einzelnen DNA-Stränge mehrere sehr deutlich bevorzugte Schnittpositionen. Diese stehen in
keinem festen Entfernungsverhältnis zu einer oder zu beiden Erkennungssequenzen und sind unabhängig von der lokalen Sequenz
der DNA, sind aber untereinander periodisch durch 10 bis 11 bp getrennt. Die Übereinstimmung dieses Abstands mit einer
kompletten Umwindung der B-DNA-Doppelhelix begründet sich wahrscheinlich aus dem Mechanismus der Komplexbildung von
McrBC.


Durch die Integration der in dieser Arbeit gewonnenen experimentellen Resultate in den Kontext der bekannten Daten über McrBC, die vor
allem in jüngerer Zeit veröffentlicht wurden, und durch Vergleiche des McrBC-Systems mit anderen Restriktionsendonukleasen und mit
anderen mit DNA interagierenden Enzymsystemen konnte in dieser Arbeit eine neue Modellvorstellung der Funktionsweise des
McrBC-Restriktionssystems entwickelt werden. Diese beschreibt die GTP-Hydrolyse durch McrB als notwendig für den Aufbau
DNA-spaltaktiver McrBC-Komplexe. Die Untereinheit McrB bewirkt als NTP-aktiviertes Signalmolekül weiterhin über die Hydrolyse des
Kofaktors eine DNA-Translokation durch den Komplex, die möglicherweise durch die Untereinheit McrC bewirkt wird. Analog zu den
HsdR-Untereinheiten der Typ I Restriktionsenzyme verursachen die translozierenden Untereinheiten durch ein externes Signal, das aus
einer mechanischen Behinderung der DNA-Translokation bei sich fortsetzender GTP-Hydrolyse besteht, eine DNA-Spaltreaktion, die
analog zu den ebenfalls DNA-Translokation betreibenden Typ III Restriktionsenzymen in der Nähe der Erkennungssequenz erfolgt. In dem in
dieser Arbeit beschriebenen Modell zum Ablauf der DNA-Spaltung durch McrBC hat die Hydrolyse des Kofaktors durch McrB nicht die
ausschließlich Funktion einer Energiequelle für den Antrieb einer DNA-Translokation, sondern moduliert die Aktivität der Untereinheit
McrC. Damit unterscheidet sich dieses Modell von den bisher beschriebenen Vorstellungen, die die Funktion der GTP-Hydrolyse durch
McrB nicht beschreiben oder von einer Rolle der GTP-Hydrolyse als direktem Antrieb der Translokation ausgehen, analog zu der
ATP-Hydrolyse von Motorproteinen.