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Entwicklungen von PCR-Methoden zur sensitiven Quantifizierung des mit der chronisch myeloischen Leukämie assoziierten BCR/ABL-Fusionstranskriptes

Freist, Annette


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Freie Schlagwörter (Deutsch): BCR/ABL-Fusionstranskript , PCR-Methode , myeloische Leukämie
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Biochemie
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.01.2001
Erstellungsjahr: 2001
Publikationsdatum: 12.04.2001
Kurzfassung auf Deutsch: Die chronisch myeloische Leukämie (CML) ist die häufigste myeloproliferative Erkrankung und stellt pathophysiologisch die erste
hämatologische Erkrankung dar, bei der eine charakteristische Chromosomenaberration, das sogenannte Philadelphia-Chromosom
(Ph+), beschrieben wurde. Dieses Chromosom stellt das Produkt einer reziproken Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22
(t(9;22)(q34;q11)) dar. In 98 % der Ph+-positiven Fälle führt diese Translokation auf dem Philadelphia-Chromosom zur Bildung eines
pathophysiologisch relevanten Fusionsgens, des BCR/ABL-Gens. Es gilt als gesichert, daß die Bildung des BCR/ABL-Gens in
hämatopoetischen Stammzellen ein wesentlicher Schritt in der Veränderung des Wachstums- und Regulationsverhaltens der Stammzelle
ist, die zum charakteristischen hämatologischen und klinischen Bild der CML führt. Daher stellt das Philadelphia-Chromosom für die CML
ein wichtiges diagnostisches und prognostisches Kriterium dar.


Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Detektion und Quantifizierung des Transkriptes des BCR/ABL-Fusionsgens zu entwickeln, die
sich für die Routineanlytik eignet und einen möglichst sensitiven Nachweis erlaubt. Unter diesen Voraussetzungen boten sich prinzipiell nur
Methoden an, die auf der Polymerase-Kettenreaktion basieren. Da die Bruchpunkte, die zur Translokation führen, über einen weiten
Bereich gestreut vorkommen, war es sinnvoll, die Quantifizierung des BCR/ABL-Fusionsgens über dessen Transkript zu führen und somit
eine quantitative RT-PCR zu etablieren. Die Quantifizierung wurde zunächst über eine quantitative kompetitive RT-PCR durchgeführt. Zur
Generierung eines internen Standards, der mit der gleichen Effizienz amplifiziert wird wie die Wildtyp-Sequenz wurde ein Plasmid mit
integriertem BCR/ABL-cDNA-Fragment generiert, welches sich in einer singulären Restriktionsschnittstelle von der
BCR/ABL-Wildtyp-Sequenz unterscheidet. Von diesem Plasmid wurde ein definiertes in-vitro-Transkripte synthetisiert und isoliert. Im
Anschluß daran durchgeführte Titrationsexperimente bestätigten, daß es sich bei dem gewählten Standard um einen idealen Standard
handelt, der mit der gleichen Effizienz wie die Wildtyp-Sequenz amplifiziert wird. Neben der Quantifizierung der RT-PCR-Produkte nach
spezifischer Restriktionsspaltung mittels densitometrischer Gelbildanalyse wird hier eine neue Quantifizierungsmethode mittels
kapillar-elektrophoretischer Auftrennung und LIF-Detektion der Fluorophor-markierten Spaltfragmente beschrieben. sie ist aber durch
einfachere Handhabung und automatische Prozessierung der Proben und automatische Analyse der gewonnenen Daten besser für die
Durchführung einer Routineanalyse geeignet.


Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, auf real-time-Detektion basierende RT-PCR-Methode zur Quantifizierung des
BCR/ABL-Transkriptes entwickelt. Diese Methode basiert auf einer online-Fluoreszenzdetektion während der PCR. In dieser Arbeit wurde
eine Ein-Schritt real-time RT-PCR entwickelt, die in der Lage ist, eine Leukämiezelle in 105 gesunden Zellen nachzuweisen und zudem
eine genaue Quantifizierung bis hinunter zu 100 Transkriptkopien erlaubt. Weiterhin erlaubt sie erstmals Quantifizierungen über einen
linearen Meßbereich von 6 Größenordnungen. Durch Verwendung von BCR/ABL-spezifischen HybProbes entfällt aufgrund der hohen
Spezifität der Sonden eine weitere Analyse der Proben. Um mögliche Qualitätsunterschiede der Patienten-RNA auszugleichen, wurde
zudem ein Primer/Sonden-System für das Transkript des housekeeping-Gens PBGD etabliert und die Methode durch Analyse von
CML-Patienten-Proben verifiziert.