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Die Rolle von Titin in der Sarkomerogenese : Untersuchungen an adulten Kardiomyozyten der Ratte in Langzeitkultur

Person, Veronika


pdf-Format: Dokument 1.pdf (30.632 KB)

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Titin , Sarkomerogenese
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für Physiologische und Klinische Forschung, W.G. Kerckhoff-Institut, Abteilung für Experimentelle Kardiologie, Bad Nauheim; eingereicht über das Institut für Veterinär-Pathologie
Fachgebiet: Veterinärmedizin
DDC-Sachgruppe: Landwirtschaft
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.11.2000
Erstellungsjahr: 2000
Publikationsdatum: 21.12.2000
Kurzfassung auf Deutsch: Die Rolle von Titin als 'molekulare Matrize' in der Sarkomerogenese wird in der Literatur oft diskutiert. In der vorliegenden Studie, wurde
die Hypothese untersucht, daß die Expression von Titin Voraussetzung für die Inkorporation der dicken Filamente in die Sarkomeren ist.
Diese Untersuchung wurde mit Hilfe von Antisense-Oligodesoxynukleotiden, die die Translation von Titin beeinflussen, am
Redifferenzierungsmodell adulter Kardiomyozyten der Ratte (ARC) in Langzeitkultur duchgeführt.
Vor der Durchführung der eigentlichen Antisense-Oligodesoxynukleotid-Experimente wurden das Wachstumsmuster und die Größe der
Zelloberfläche der unterschiedlichen Phänotypen der ARC in Langzeitkultur bestimmt und standardisiert. Dies stellt die Grundlage für die
Antisense-Oligodesoxynukleotid-Experimente dar, die mittels drei für Titin-mRNA-spezifischen Antisense Phosphorothioat
Oligodesoxynukleotiden (Antisense S-ODN) in einer Konzentration von 10 [my]mol durchgeführt wurden.
In Vorversuchen mit Hilfe von Fluorescein-markierten S-ODN konnte die Aufnahme in die ARC im Konfokalen Lasermikroskop
nachgewiesen werden. Desweiteren war sowohl bei Antisense als auch bei Random S-ODN eine signifikante Zunahme der Zellgröße im
Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen zu verzeichnen.
Die Antisense S-ODN-Behandlung verursachte am 12. und 16. Tag in Kultur eine deutlich reduzierte Expression von Titin und eine Störung
der Myosininkorporation in die Sarkomeren. Diese Störung war überwiegend durch eine diffuse Myosinmarkierung und durch eine
signifikante Abnahme der regelmäßigen Myosinquerstreifung im Verhältnis zur gesamten Zellfläche (Tag 12 und 16: Kontrolle 75%, Tag 12:
S-ODN I und II 20%, Tag 16: S-ODN I und II 14%) gekennzeichnet. Die zelluläre Integrität, definiert durch das Vorhandensein des typischen
[alpha]-Aktinin-Musters und der Streßfaser-artigen Strukturen, war nicht gestört.
Diese Ergebnisse liefern entscheidende Hinweise für die Richtigkeit der Hypothese, daß Titin ein Rolle als 'molekulare Matrize' spielt,
indem es die Inkorporation der Myosinfilamente in die Sarkomeren koordiniert. Die Anwesenheit von Titin ist somit eine Voraussetzung für
die Sarkomerogenese.
Kurzfassung auf Englisch: An essential role of titin as a 'molecular ruler' in sarcomerogenesis has been frequently discussed. In this study, we tested the hypothesis
that the expression of titin is a prerequisite for thick filament incorporation into sarcomeres by utilizing an antisense oligodeoxynucleotide
approach to interfere with titin translation in the redifferentiation model of adult rat cardiomyocytes (ARC) in long-term culture.
As a first step, the growth pattern ranging from rod shaped to round and later to spreading cells and the cell surface area of ARC were
quantitatively evaluated and standardized. This represents the basis for experiments interfering with sarcomere formation using three
different antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides (S-ODN) at a dosage of 10 [my]M specific for titin mRNA.
The presence of fluorescein-labeled S-ODN in ARC indicated cellular uptake of antisense and random S-ODN, and both induced a
significant increase in cell size as compared with untreated ARC serving as control.
At days 12 and 16 in culture, antisense S-ODN treatment resulted in reduced expression of titin and a disturbance of myosin incorporation
into sarcomeres, which is evident by diffuse myosin labeling in the majority of cells and a significantly decreased area of regular myosin
cross-striation (day 12 and 16: control 75%, day 12: S-ODN I and II 20%, day 16: S-ODN I and II 14%) as observed by laser scanning
confocal microscopy. Cellular integrity indicated by the presence of [alpha]-actinin and F-actin was not disturbed.
These findings provide evidence for the role of titin as a molecular template for myosin incorporation and therefore titin is a prerequisite for
sarcomerogenesis.