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Reinigung des nierenspezifischen Glykoproteins gp400 mittels Immunaffinitätschromatographie

Bodemer, Lucia


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Glykoprotein gp400 , Immunaffinitätschromatographie
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Nephrologisches Labor des Zentrums für Innere Medizin, Medizinische Klinik II
Fachgebiet: Haushalts- und Ernährungswissenschaften - Ökotrophologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2000
Erstellungsjahr: 2000
Publikationsdatum: 14.12.2000
Kurzfassung auf Deutsch: Durch die Immunisierung von Mäusen mit renalen Bürstensaummembranen vom Schwein wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. H.
Koepsell eine Reihe von monoklonalen Antikörpern generiert, die bereits ausführlich charaktierisiert wurden. Das nierenspezifische
Antigen des monoklonalen Antikörpers N4A4 wurde von den Autoren als gp400 bezeichnet. Klinisch konnte eine Eignung des
monoklonalen Antikörpers N4A4 für die nichtinvasive Urindiagnostik nachgewiesen werden, da gp400 bereits unter physiologischen
Bedingungen in den Urin ausgeschieden wird. Da gp400 auch in Nierenzellkarzinomen proximaltubulären Ursprungs exprimiert wird, wird
derzeit untersucht, inwiefern der Antikörper in Diagnostik und Therapie dieser Tumoren eingesetzt werden kann.


Die Identität von gp400 ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit hatte deshalb das Ziel, dieses Protein mit Hilfe von
proteinchemischen und immunologischen Methoden aufzureinigen, um nachfolgend eine Sequenzierung zu ermöglichen.


Initial konnte mit einer Endosomenpräparation aus dem Nierencortex von Schweinen eine ca. zehnfache Anreicherung des gp400 erzielt
werden. Diese Vesikelfraktion wurde als Ausgangsmaterial für die sich anschließenden Reinigungsschritte eingesetzt. Für die
Solubilisierung von gp400 wurde nach einem Vergleich verschiedener Detergenzien das anionische Detergenz Cholat in einer
Konzentration von 2 % (w/v) ausgewählt.


Die Lektinaffinitätsreinigung mit Concanavalin A konnte keine weitere Anreicherung des gp400 erzielen. Dies lag sehr wahrscheinlich an
Wechselwirkungen zwischen Lektin und Detergenz. Die isoelektrische Fokussierung erbrachte zwar eine weitere Konzentrierung des
gp400, kam jedoch aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwands nicht zum Einsatz. Der isoelektrische Punkt von gp400 wurde
mit 6,14 bestimmt.


Zur Immunaffinitätschromatographie kam eine Protein G Säule mit kovalent gekoppelten monoklonalen Antikörpern zum Einsatz. Mit dem
monoklonalen Antikörper N4A4 konnte gp400 nicht isoliert werden. Es wurde angenommen werden, daß die gleichzeitige Anwesenheit
des Detergenzes Cholat eine Antigen-Antikörperbindung unterband. Unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers L4D6 gelang die
Isolierung von gp400. Da der monoklonale Antikörper N4A4 im Western Blot mit dem von der L4D6-Säule eluierten Protein positiv
reagierte, konnte bewiesen werden, daß das Antigen beider Monoklonaler identisch ist. Die L4D6-Säule wurde deshalb für die Isolierung
des gp400 eingesetzt. Ca. 125 pmol des gesuchten Proteins konnten somit gewonnen werden.


Das aufgereinigte Protein sollten nach Konzentrierung mittels Ultrafiltration und enzymatischem Verdau im Gel einer
Aminosäurensequenzanalyse zugeführt werden. Obwohl hierbei vage eine Sequenz gelesen werden konnte, die eine 90 %ige Homologie
zu einem nicht näher definierten humanen cDNA Klon besaß, muß angezweifelt werden, daß diese Sequenzdaten dem gp400 zuzuordnen
sind. Vermutlich ging der Großteil des aufgereinigten gp400 bereits bei der Ultrafiltration verloren.
Kurzfassung auf Englisch: Immunizing of mice with porcine renal brush border membranes by Prof. H. Koepsell and coworkers resulted in the generation of different
monoclonal antibodies. These antibodies already have been characterized in detail. One of these monoclonal antibodies, N4A4,
recognizes a kidney specific antigen named gp400 and can be used for noninvasive urinary diagnostics as gp400 is excreted into the urine
under physiological conditions. As gp400 is expressed in renal cell carcinomas of proximal tubular origin a current study determines
whether N4A4 can be used as a diagnostic tool or a therapeutic agent for these tumors.


Since the identity of gp400 is still not known, the goal of the here presented work was the purification of gp400 with biochemical and
immunological methods to allow amino acid sequencing.


An approximate tenfold enrichment of gp400 could be initially achieved by vesicle preparation of porcine renal cortex. This vesicular
fraction was used as starting material for further purification steps. After comparing different detergents, the anionic detergent cholic acid
was used at a concentration of 2 % (w/v) to solubilize gp400.


Lectinaffinity purification with concanavalin A did not result in an enrichment of gp400, probably due to interactions between lectin and
detergent. In contrast isoelectric focusing could be used to further concentrate gp400 and to determine its isoelectric point at 6,14, but was
not practical for large-scale purification.


Therefore we tried Protein G with covalently coupled monoclonal antibodies as immuno affinity chromatography. GP400 could not be
purified using N4A4 most likely due to interference between cholic acid and the antigen-antibody-binding. However, after using L4D6
isolation of gp400 was achieved. As N4A4 showed a positive reaction in western blotting of the protein eluted from the L4D6 column it was
proven that the antigen of both monoclonals is identic. A total of 125 pmol of gp400 could be recovered.


After concentration by ultrafiltration and in gel digest an attempt was made to determine the amno acid sequence of gp400. Although some
sequence data, which showed 90% homology to a protein encoded by a yet uncharacterized human cDNA clone could be obtained it
should be doubted whether the sequence belongs to gp400. Presumably the biggest amount of purified gp400 was already lost during
ultrafiltration.