Giessener Elektronische Bibliothek

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URN: urn:nbn:de:hebis:26-opus-3007
URL: http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2000/300/


Untersuchung der GAP-katalysierten GTP-Hydrosereaktion von Ras und Rap

Brinkmann, Thilo


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Freie Schlagwörter (Deutsch): Ras , Rap , GTP-Hydrosereaktion
Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Max-Planck-Institut für Molekulare Physiologie, Dortmund
Fachgebiet: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2000
Erstellungsjahr: 2000
Publikationsdatum: 12.12.2000
Kurzfassung auf Deutsch: Ein Ziel dieser Arbeit bestand in der Entwicklung einer Leitsubstanz für die Herstellung eines Anti-Tumorpräparates, das an der defekten
GTPase-Funktion von onkogenem Ras ansetzen sollte. Für die Entwicklung eines deratigen Wirkstoffes durch drug design spricht aufgrund
der Tatsache, dass in 30% aller menschlichen Tumore onkogene Ras-Mutationen gefunden werden, die Singularität des Angriffspunktes.
Um einen Ausgangspunkt für molekulares drug design zu erhalten, wurden Peptidbibliotheken entworfen, synthetisiert und auf
RasGAP-Aktivität untersucht.


Unter Zuhilfenahme der Röntgenkristallstruktur des Komplexes von Ras mit seinem GTPase-aktivierenden Protein im Übergangszustand
der GTP-Hydrolysereaktion und eines Vergleiches der bekannten RasGAP-Sequenzen, wurden eine Kernsequenz identifiziert, die als
Grundlage für den Entwurf der kombinatorischen Peptidbibliotheken diente. Alle Peptide besitzen die gemeinsame Kernsequenz (RGQ),
die von definiert und zufällig variierten Aminosäuren flankiert wird. Jede Bibliothek besitzt eine Komplexität von 160000 verschiedenen
Peptiden. Zusammen enthalten alle Bibliotheken somit 64 Millionen verschiedene Peptide. Die Bibliotheken wurden in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe Molekulare Erkennung von Dr. Ronald Frank aus an Festphasen gekoppelten Peptiden nach der sogenannten
SPOT-Synthese-Methode hergestellt. Zum Nachweis von GAP-Aktivität wurden die einzelnen Peptidbibliotheken parallel in
Mikrotiterplatten mit onkogenem und wt Ras, das zuvor mit radioaktiv markiertem GTP beladen wurde, inkubiert. Zur Quantifizierung der
Aktivität wurde ein eigens für das Mikrotiterplattenformat adaptierter und modifizierter Filterbindungstest durchgeführt. Es wurden neben
linearen auch zyklisierte Peptidbibliotheken getestet. In den durchgeführten Tests konnte kein Peptid mit GAP-Aktivität identifiziert werden.


Der zweite Teil dieser Arbeit galt der Untersuchung des GTPase-aktivierenden Proteins Rap1GAP für das Ras-homologe Protein Rap1.
Besonders berücksichtigt wurde dabei die Frage, ob sich Rap1GAP wie die GAP für Ras, Rho und Ran ebenfalls eines sogenannten
Argininfingers bedient, um die intrinsische GTP-Hydrolysereaktion der jeweiligen kleinen GTPase zu beschleunigen. Hierzu wurde zunächst
ein Protokoll für die Herstellung eines katalytischen Fragments als GST-Fusionsprotein in E. coli und die anschließende Reinigung
etabliert. Die maximale Geschwindigkeit der von Rap1GAPv katalysierten GTPase-Reaktion von Rap1A wurde nach Michaelis-Menten mit
5,6 s-1 bestimmt, der KM-Wert wurde mit 52,3 µM bestimmt. Aufgrund der eingeschränkten Stabilität des Fragments konnte die Affinität
von Rap1GAPv zu Rap1 nicht exakt bestimmt werden.


Nach Herstellung von Rap1GAPv-Varianten, in denen je eine konservierte Argininseitenkette durch eine Lysin- oder Alaninseitenkette
substituiert wurde, konnte durch kinetische Untersuchung der katalytischen Eigenschaften gezeigt werden, dass keine der
Argininseitenketten einen Einfluss auf die GTP-Hydrolysereaktion aufweist, der dem des Argininfingers von RasGAP vergleichbar ist.
Durch weitere kinetische Untersuchungen mit Rap1GAP-Varianten, in denen konservierte polare Aminosäurenseitenketten von Rap1GAP
durch Alaninseitenketten ersetzt wurden, konnte Lysin 285 als katalytisch relevante Seitenkette identifiziert werden. Damit verwendet
Rap1GAP möglicherweise einen Lysin-Finger zur Katalyse der GTPase-Reaktion von Rap1.


In weiteren Mutagensestudien wurden die Aminosäureseitenketten Glycin 12 und Tyrosin 32 von Rap1A durch Valin respektive Tryptophan
ersetzt. Im Gegensatz zu den analogen Substitutionen bei Ras zeigte sich die GTPase-Reaktion der G12V-Variante als GAP-stimulierbar,
wohingegen die Y32W-Variante ebenfalls von der Situation bei Ras abweichend nicht durch GAP zu stimulieren ist. Eine direkte
Beteiligung der Hydroxylgruppe des Tyrosins konnte durch die Untersuchung einer Variante mit der Substitution Y32F ausgeschlossen
werden. Zusammen mit der Tatsache, dass im Gegensatz zu allen anderen GTPasen bei Rap das streng konservierte Glutamin des Motivs
PM3 durch ein Threonin ersetzt ist, resultiert aus den Untersuchungen dieser Arbeit die Annahme eines alternativen
GTP-Hydrolysemecha-nismus für die Rap1GAP-katalysierte GTP-Hydrolyse von Rap.