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Sequenzierung von Peptaibol-Antibiotika mittels Flüssigkeitschromatographie-Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometrie

Jaworski, Andreas


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Universität Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut: Institut für Ernährungswissenschaft, Professur für Lebensmittelwissenschaften
Fachgebiet: Haushalts- und Ernährungswissenschaften - Ökotrophologie
DDC-Sachgruppe: Haushaltswissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.01.1970
Erstellungsjahr: 2000
Publikationsdatum: 10.02.2000
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zu entwickeln, mit der Peptaibole (lineare Peptide, die u.a. a-Aminoisobuttersäure (Aib) und einen Aminoalkohol
beinhalten) schnell sequenziert werden können. Die massenspektrometrische Untersuchunge der Peptide erfolgte nach HPLC
(Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie)-Trennung der Komponenten unter Verwendung eines ESI-MS (Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometer) und
MSn (multiple MS) von charakteristischen Fragment-Ionen im positiven- und negativen- Ionisierungsmodus. Die in der Literatur beschriebenen
massenspektrometrischen Fragmentierungsmechanismen von Peptiden sollten hierbei im Hinblick auf die ungewöhnlichen Peptaibolstrukturen kritisch betrachtet
und evtl. auftretende Abweichungen mechanistisch erklärt werden.


Durch die Kopplung des Massenspektrometers mit HPLC entfiel die kosten- und materialintensive semipreparative Reinigung der mikroheterogenen
Komponenten. Es konnte gezeigt werden, daß die Ergebnisse von ESI-MSn im positiven Ionisierungsmodus durch Untersuchungen im negativen
Ionisierungsmodus komplettiert und erweitert werden. Mögliche Mechanismen der im negativen Ionisierungsmodus gebildeten Fragmente konnten formuliert
werden.


Der Einsatz einer Fluorkohlenwasserstoff-Phase ergänzte die Verwendung einer normalerweise zur Peptidtrennung eingesetzten ODS-Phase (Octadecylsilyl-)
vorteilhaft. Die Fluorkohlenwasserstoff-Phase weist eine von ODS-Phasen abweichende Trenncharakteristik auf. Komponenten, die auf stationären Phasen
vom ODS-Typ koeluieren, werden unter Verwendung dieser Phase oft getrennt.


Die GC-MS (Gaschromatographie-Massenspektrometrie) Analyse von aus den Peptaibolen generierten Trifluoracetyl-Dipeptid-Methylestern ermöglichte die
Bestimmung der Positionen von mittels ESI-MS nicht zuordenbaren isomeren Aminosäuren (AS). Die Methode erlaubte weiterhin, auch nicht kommerziell
erhältliche Dipeptide durch Generierung aus definierten Peptaibolen zu erhalten und diese aufgrund ihres Massenspektrums zu identifizieren.


Die Chiralität und Stöchiometrie der in den Peptaibolen enthaltenen AS wurde mittels GC-MS Untersuchungen in Form unterschiedlicher
Perfluoracyl-AS-Alkylester-Derivate auf chiraler und nicht-chiraler stationärer Phase ermittelt.


Durch die angewandten Methoden konnten 12 bisher nicht bekannte Peptaibole (Trichovirin II 1a - 6b) aus Trichoderma viride NRRL 5243 sequenziert und
die Sequenzen dem HPLC Elutionsprofil zugeordnet werden. Bakterizide und hämolytische Aktivitäten des mikroheterogenen Peptidgemisches wurden
ermittelt.


Im weiteren wurde das mikroheterogene Peptaibolgemisch Trichotoxin A-40 (TT A-40) untersucht. Es zeigte sich, daß TT A-40 nur unter Verwendung eines
Eluenten mit niedrigem pH-Wert von der verwendeten ODS-Phase eluiert wurde. Durch HPLC-ESI-MSn wurden drei bereits publizierte Sequenzen bestätigt
und dem HPLC-Elutionsprofil zugeordnet. Weiterhin konnten eine weitere Hauptsequenz (TT A-40/5) und zwei weitere Minorkomponenten (TT A-40/1 und
2) sequenziert, dem charakteristischen HPLC-Elutionsprofil zugeordnet und prozentuale Anteile angegeben werden.


Aus Submerskulturen von Stilbella erythrocephala ATCC 28144, Stilbella fimetaria CBS 548.84 und Gliocladium catenulatum CBS 511.66 wurde
Antiamoebin (AAM) isoliert. Die Isolate wurden mittels HPLC unter identischen Bestimmungen mit AAM-Isolaten aus Emericellopsis poonensis ATCC
16411 (Hindustan Antibiotics), E. synnematicola ATCC 16540 (Sigma), E. salmosynnemata CBS 382.62 (TÜ 165) und E. synnematicola CBS 176.60
verglichen.


Die Untersuchungen bewiesen, daß AAM I die Hauptkomponente in allen Isolaten darstellt. AAM II konnte nur in dem zur erstmaligen Sequenzierung
eingesetzten Isolat aus E. poonensis ATCC 16411 (Hindustan Antibiotics) in geringen Mengen (1.9 %) nachgewiesen werden. Der in der Literatur
beschriebene Gln11/Glu11-Austausch in AAM III konnte nicht bestätigt werden, die für AAM III beschriebene Sequenz wurde berichtigt. Auch die komplette
Sequenzierung der AAM IV und V, von denen Teilsequenzen beschrieben waren, wurde durchgeführt.


Neben diesen 5 Antiamoebinen konnten mittels HPLC-ESI-MS-MS 11 weitere Sequenzanaloga in ihrer Primärstruktur aufgeklärt, dem HPLC Elutionsprofil
zugeordnet und deren relative Anteile ermittelt werden.
Kurzfassung auf Englisch: The topic of this work was the development of fast and reliable methods to permit the sequencing of microheterogeneous linear peptides. Owing to the
presence of a-aminoisobutyric acid (Aib) residues and a C-terminal amino-alcohol, these peptides belong to the family of peptaibol antibiotics. The sequence
determination was carried out using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled to electrospray ionization mass-spectrometry (ESI-MS) and
MSn (multiple MS) of characteristic fragments in the positive- and negative-ionization mode. This method made possible the sequence elucidation of
components without previous isolation and allowed, in certain cases, the sequence determination of peptides which were incompletely or not resolved by
HPLC. Application of the negative ionization mode completed and ensured the sequence determination in the positive ion mode. A proposed mechanism for
the formation of fragments in the negative ionization mode was formulated.


The use of a fluorocarbon-coated silica stationary phase made possible the sequencing of peptides which were not resolved on common used octadecylsilyl-
(ODS) stationary phases. The GC-MS (gas chromatography-mass-spectrometry) analysis of generated trifluoroacetyl-dipeptide-methylesters allowed the
determination of positions of isobaric amino acids (AA) Val and Iva, which could not be distinguished by ESI-MS. Reference dipeptides not available, were
generated by methanolysis from peptaibols of known sequences and identified by their mass spectrum via GC-MS.


The determination of chirality and stoichiometry of contained AA was carried out using perfluoroacyl-AA-alkylester derivatives determined by GC-MS
applying chiral and non-chiral stationary phases.


By application of these methods the sequences of twelve peptaibols (Trichovirin II 1a - 6b) isolated from Trichoderma viride strain NRRL 5243 were
elucidated and were correlated to the HPLC elution profile (fingerprint). Bactericidal and hemolytic activities of the microheterogeneous mixture of peptides
were determined.


Peptaibol trichotoxins A-40 (TT A-40) were reinvestigated. Elution of TT A-40 peptides from the employed ODS stationary phase required the use of an
acidic mobile phase. By the use of HPLC-ESI-MSn the structures of two major and one minor component could be confirmed and hitherto not known
sequences of a further major and two minor peptides could be determined and correlated to the HPLC elution profile.


Mixtures of the microheterogeneous 16-mer peptaibol antibiotic antiamoebin (AAM) were isolated from the culture broths of the filamentous fungi Stilbella
erythrocephala ATCC 28144, Stilbella fimetaria CBS 548.84 and Gliocladium catenulatum CBS 511.66. Further, HPLC elution profiles and sequences
from a sample originally used for sequencing AAM (from Hindustan Antibiotics), and a sample of AAM commercially available (from Sigma Chemicals) were
assigned. Sequences of AAM previously isolated from Emericellopsis synnematicola CBS 176.60 and Emericellopsis salmosynnemata CBS 382.62 were
also determined. The peptide designated AAM I was the most abundant in all isolates and its structure could be confirmed. AAM II was detectable as a minor
component (1.9 %) only in the original sample of AAM, but not in the other isolates. The structures of AAM III, IV and V, which had previously been
assigned partly, were definitely established, and the new sequences AAM VI - XVI were elucidated. AAM showing Phe1/Leu1 or Phe1/Val1 exchange,
respectively, are produced in amounts only by Stilbella erythrocephala. Sequences, HPLC elution profiles, and relative amounts of peptides of all isolates
were correlated.